Genetika multifaktorijalnih bolesti dr Jelena Karanović, istraživač saradnik Centar za humanu molekularnu genetiku Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu jkaranovic@bio.bg.ac.rs Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017

Faktor 1 Faktor 4 Faktor 3 Faktor 2 Faktor N Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017

Multifaktorijalne bolesti (MF bolesti) Primeri bolesti: kardiovaskularne bolesti, različite vrste karcinoma, psihijatrijske bolesti... Faktori rizika ili protekcije: epigenetički, genetički, sredinski (sinergizam) Efekti faktora: direktni (glavni, nezavisni, individualni) i indirektni (interaktivni) Epigenetika Genetika MF fenotip Sredina Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 3

Retke bolesti vs. Multifaktorijalne bolesti Genetički faktori Retke bolesti vs. Multifaktorijalne bolesti Retka promena u sekvenci DNK (Mutacija) Retka bolest Retke ili česte promene u sekvenci DNK (Genetičke varijante) Multifaktorijalna bolest

Genetički faktori Genetičke varijante (polimorfizmi sekvence DNK) Razlike u sekvenci DNK između dve osobe u populaciji Učestalost veća od 1% (ali ima i retkih varijanti, <1%) Aleli Različite varijante nekog gena ili sekvence DNK Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 5

Genetičke varijante (polimorfizmi sekvence DNK) Tipovi: Varijante (polimorfizmi) nukleotidne sekvence Varijante (polimorfizmi) broja kopija Varijante (polimorfizmi) dužina sekvence Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 6

Varijante (polimorfizmi) nukleotidne sekvence Tačkaste varijante (single nucleotide variants - SNVs ili single nucleotide polimorphisms - SNPs): čine 90% svih genetičkih varijanti – oko 10 miliona SNVs u genomu čoveka Česte (učestalije od 1%): mala penetrabilnost Retke (učestalost manja od 1%): velika penetrabilnost Sinonimne (neutralne-osim ukoliko se ne nalaze u mestu za splajsovanje) Nesinonimne (uglavnom funkcionalne) Inserciono-delecione varijante: Indel varijante: insercije/delecije 1-50 nukleotida Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 7

Varijante (polimorfizmi) broja kopija Varijacije u broju kopija (Copy-number variations -CNVs): Razlike u broju kopija gena ili neke druge sekvence DNK od 0.5kb do nekoliko megabaza u odnosu na referentni genom Delecije/duplikacije/kompleksne Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 8

Varijante (polimorfizmi) dužine sekvence Razlike u broju tandemski ponovljenih sekvenci – 5-50x Mikrosateliti – short tandem repeat polymorphisms (STRs): ponovak dužine 1-5bp Minisateliti – variable number tandem repeats (VNTRs): ponovak dužine ≥6bp Molekularni markeri u linkage studijama Utvrđivanje DNK profila u forenzičkoj genetici Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 9

Genetički faktori Velika genetička varijabilnost Dve osobe (osim jednojajčanih blizanaca) imaju oko 99% identičnu sekvencu DNK 0.5% razlika potiče od SNVs...približno 1 nukleotid na 1000=SNV 0.4% razlika potiče od CNVs 0.1% razlika potiče od ostalih retkih varijanti Individualne razlike su veće nego među populacijama Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 10

Pristupi u izučavanju MF bolesti Familijarne – linkage studije Pomoću molekularnih markera utvrđuje se da li član porodice nosi rizik za MF bolest Testiranje retkih varijanti Populacione – studije genetičke asocijacije Procena uticaja genetičkih faktora na razvoj MF bolesti u populaciji Testiranje čestih varijanti (uglavnom) Statističke asocijacije usmeravaju dalje testiranje identifikovanih varijanti u funkcionalnim studijama Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 11

Studije genetičke asocijacije – pristupi Geni kandidati Na “maloj” skali (pojedinačne, desetine, stotine, hiljade genetičkih varijanti) Hipoteza na osnovu biološke funkcije produkata gena GWAS (genome-wide association studies) Na velikoj skali (stotine, hiljade, milioni genetičkih varijanti) Nema početne hipoteze GWIS (genome-wide interaction studies) GWAS katalog: www.ebi.ac.uk/gwas Last data release on 2017-12-11 3233 publications/studies 55707 unique SNP-trait associations Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 12

Studije genetičke asocijacije – pristupi Hipoteza “česta bolest-česta varijanta” Česte genetičke varijante daju samo mali doprinos razvoju MF bolesti Jedna genetička varijanta nije niti neophodan niti dovoljan uslov za razvoj MF bolesti Kumulativan efekat Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 13

Studije genetičke asocijacije – pristupi Česte tačkaste genetičke varijante Iz literature ili prema biološkoj funkciji - poznatoj ili predviđenoj Direktna asocijacija sa fenotipom Tag varijante (tagSNPs, tagSNVs) Testiranje jedne varijante daje informaciju o ostalim varijantama u okviru istog haplobloka U osnovi je fenomen Linkage disequilibrium-a (LD): neslučajna asocijacija alela na dva ili više lokusa na istom hromozomu Indirektna asocijacija sa fenotipom Značajno se redukuje broj testiranih varijanti 10 miliona varijanti pokriveno sa 300,000-600,000 tag varijanti Linkage disequilibrium (LD) Termin iz populacione genetike Neslučajna asocijacija alela na dva ili više lokusa na istom hromozomu Značajno češća ili ređa kombinacija alela (genetičkih markera) u populaciji u odnosu na nasumično (očekivano) formiranje haplotipova zasnovano njihovoj na frekvenciji U osnovi je fenomen DNK rekombinacije Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 14

Genetičke baze podataka www.hapmap.org (više nije u funkciji) www.1000genomes.org www.ensembl.org exac.broadinstitute.org (Exome Aggregation Consortium – ExAC) http://gnomad.broadinstitute.org/ (Genome Aggregation Database ) Katalog humanih genetičkih varijanti (uglavnom čestih tačkastih, ali sve više ima i retkih i CNVs) Sadrže informacije o varijantama: gde se nalaze, kog su tipa i koliko su učestale u različitim populacijama Ne sadrže fenotipske podatke (zaštita poverljivih podataka o pacijentima) Na osnovu njih istraživači mogu da otkriju koje su varijante povezane sa određenim bolestima Veliki doprinos za prevenciju, dijagnostiku i lečenje bolesti ExAC trenutno preko 60000 egzoma sekvencirano, uskoro 135000 egzoma, plus 15000 kompletnih genoma (podaci iz 2016. godine) Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 15

Studije genetičke asocijacije Dizajn De novo Replikativne Meta analize: veća statistička moć Longitudinalne: praćenje progresije/regresije bolesti i farmakogenetika Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 16

Studije genetičke asocijacije – vrste studija Populacione studije (unrelated) ukoliko je potvrđena heritabilnost slučajevi i kontrole (case-control): kontrole su iz opšte populacije (nepoznat status MF fenotipa) ili supernormalne kontrole (zdrave u pogledu kliničkog entiteta koji se ispituje) samo slučajevi (case-only) Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 17

Studije genetičke asocijacije – redosled Sakupljanje uzorka Demografski podaci (pol, starost, etnička pripadnost...) i razni podaci od interesa Uniformnost uzorka Veličina uzorka Genotipizacija PCR, RFLP, Sangerovo sekvenciranje, čipovi, NGS... Kontrola kvaliteta Statistička analiza Testiranje Hardy-Weinberg-ove ravnoteže Testiranje asocijacije alela/genotipova/haplotipova, analiza varijanse... Regresioni modeli (linearni/logistički) Različiti on-line ili komercijalni statistički programi (user-friendly ili programiranje) Parametri: verovatnoća (p), odnos verovatnoća (odds ratio, OR), relativni rizik Frekvencije alela i genotipova ostaju transgeneracijski konstantne u velikoj opštoj populaciji u kojoj je ukrštanje slučajno i nema mutacija, migracija, selekcije i genetičkog drifta. Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 18

Studije genetičke asocijacije – komplikacije Dodatno usložnjavanje MF fenotipa Plejotropija (jedan gen – više različitih fenotipova)-nespecifičan MF marker Preklapanje simptoma (više fenotipova sa istim/sličnim simptomima) Geni modifikatori Redukcija složenosti Intermedijarni fenotipovi (endofenotipovi) MF fenotip 1 MF fenotip 2 MF fenotip 1 MF fenotip 3 MF fenotip 4 Gen MF fenotip 2 MF fenotip n MF fenotip n Ispituje se set/podskup gena koji definišu samo deo finalnog fenotipa (endofenotip) radi pojednostavljivanja. Set gena 1 Endofenotip 1 Genetika = n gena Set gena 2 Endofenotip 2 MF fenotip Set gena n Endofenotip n Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 19

Studije genetičke asocijacije – ograničenja Statistička ograničenja Greška tipa I Detekcija nepostojećih efekata najčešće α=0.05 (za jedan SNV) Greška tipa II Nema detekcije pravih efekata najčešće β=0.2 Moć studije P=1-β (optimalno ≥80%) Smanjenje grešaka: povećanje veličine uzorka, bolja kontrola fenotipizacije, gušća genotipizacija. Izazov danas: adekvatna FENOTIPIZACIJA i statističke ANALIZE velike količine podataka Zlatni standard: GENOTIPIZACIJA We define the power of an association test to be the probability that the association test rejects the null hypothesis under the condition that the polymorphism is truly associated with the phenotype. FIGURE 1. Distribution of the test statistic under both null (left) and alternative (right) hypotheses. The vertical line is the critical value of the test. The black and gray areas under the alternative hypothesis represent the power of the test. The shaded gray area refers to the type I error rate of the test. The unshaded area under the alternative hypothesis is the probability of committing a type II error. Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 20

Studije genetičke asocijacije – nekonzistentnost u rezultatima Pozitivna/negativna asocijacija? Rizik/protekcija? Uzrok: Nedovoljne veličine uzorka tj. moći nekih studija Razlika u demografskim podacima (pol, starost, socioekonomski status) Postojanje diferencijalne ili dodatne dijagnoze Uticaj lekova Etničke razlike Metodološka ograničenja (objektivna i subjektivna)... Rešenja: Uticaj mogućih kovarijata (covariates) treba kontrolosati tokom statističke obrade podataka (adjustments) Adekvatno tretirati moguće konfaundere (confounders) Bonferroni korekcija ili permutacije za multipla testiranja Kontrola stratifikacije u uzorku Neophodnost replikativnih studija koje imaju veliku statističku moć Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 21

Kompleksnost MF fenotipa Heritabilnost (h2) = udeo genetičke varijanse u ukupnoj varijansi fenotipa. Određena familijarnim studijama, studijama na blizancima i studijama sa usvojenom decom Studije genetičke asocijacije – napredak u realnijoj proceni h2 “missing h2” = retke genetičke varijante, interakcije između gena/varijanti i/ili između gena i sredine Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 22

Interakcije u osnovi MF bolesti – najčešće ispitivane Između gena (genetičkih varijanti) – epistatičke interakcije Statističke Nisu stvarne (biološke) Koji interakcija alela sa različitih lokusa povećava/snižava rizik za MF Između gena i sredine – GxE interakcije Koji genotip(ovi) u interakciji sa sredinom povećavaju/snižavaju rizik za MF Epigenetika MF fenotip Genetika Sredina Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 23

Predispozicija za MF bolest Individualna osetljivost/podložnost (susceptibility) za MF bolest Osetljivost/podložnost je nasledna je u porodicama Osetljive/podložne osobe imaju veći broj visoko-rizičnih alela (prag osetljivosti je fiksiran, a kriva MF fenotipa pomerena udesno) Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 24

Interpretacija rezultata studija asocijacije Cilj studija genetičkih asocijacija je razvoj genetičkih testova za otkrivanje predispozicije za MF bolesti (na osnovu individualanog DNK profila) Farmakogenomika: utvrđivanje optimalnog/individualnog odgovora na terapiju Neophodnost replikativnih konzistentnih nalaza - stabilni specifični markeri MF fenotipa Statisička asociranost ≠ uzročnost Oprez prilikom tumačenja, posebno u odnosu sa pacijentima U vidu procenta ili verovatnoće rizika? Naglašavanje složene etiologije MF bolesti Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017 25

U našim rukama – kontrola okidača MF bolesti Jelena Karanović Uvod u mol. dijagnostiku humanih bolesti, 2017