1. Donor Selection for HSCT
Prof. Ilona Hromadníková, Ph.D.
Department of Molecular Biology and Cell Pathology
Third Medical Faculty, Charles University in Prague

2. Selection criteria HLA compatibility
If selection is possible among more donors -
consideration of:
age
younger is more suitable, usually not donors > 60 years
Czech Donor Register: Donor age has to be between 18 – 35 years when firstly included into the registr.
sex
female to male BMT – risk of GvHD especially when female is alloimmunized against H-Y and other antigens of minor histocomp. system, male to female with SAA BMT – higher rejection risk
Hlavním kriterium výběru dárce je HLA kompatibilita. Cílem je snaha vybrat dárce pokud možno co nejvíce HLA-shodného, ale nemusí tomu tak být vždy. Např. pro nemocného s leukemií může být jednovaječné dvojče méně vhodným dárcem než jiný shodný sourozenec, protože riziko relapsu je u syngenní TKD vyšší.
Je-li možnost výběru mezi více dárce, přihlíží se také k:
H-Y is a histocompatibility antigen of the cell membrane, determined by a locus on the Y chromosome; it is a mediator of testicular organization (hence, sexual differentiation) in the male.
ČNRDD-český národní registr dárců dřeně

3. AB0- and Rh- blood groups
Selection criteria
If selection is possible among more donors -
consideration of :
AB0- and Rh- blood groups
not significant risk factor, however, necessary to know
if incompatible – remove erythrocytes and plasma
immunity against CMV
risk of infection transfer, when donor pos. and recipient neg.
CMV positivity → unfavourable influence on development and course of GvHD even if no clinical symptoms of infection

4. Contra-indication for donation
infectious diseases transmitted by blood
antibody screening: syphilis, hepatitis B, C, HIV-1/HIV-2, CMV (IgM, IgG)
because of general anaesthesia mainly:
cerebrovascular diseases
fresh heart attack
respiratory insufficiency
malignancies
pregnancy

5. HLA system of histocompatibility
Tissue compatibility is determined by genes of the major histocompatibility complex, known as the HLA systém in man, that are clustered on the short arm of chromosome 6.
Geny odpovědné za tkáňovou histokompatibilitu jsou umístěny na krátkém raménku 6. chromozomu. Zde se nacházejí geny pro I. a II.třídu antigenů HLA. V důsledku obrovského polymorfismu HLA antigenů (mnoho variant genů, tj. alel) individuálně charakterizují každého člověka, což se týká i systému transplantačních antigenů.
Tato různorodost si vynucuje pečlivou typizaci při výběru vhodných dvojic dárce-příjemce před Tx.
Pro Tx jsou důležité antigeny HLA I třídy A, B, C a HLA II třídy DR, DP, DQ. Zvláště významné jsou A, B a DR.
huge gene polymorphism
Tx - important antigens HLA class I A, B, C
HLA class II DR, DP, DQ

6. HLA class I
expressed on cell surface of nucleated cells, thrombocytes
antigen presentation to CD8+ T lymphocytes
cca 20 genes, most important HLA A, B, C
HLA class II
expressed on antigen presenting cells (DC, B lympho, macrophages)
antigen presentation to CD4+ T lymphocytes
3 gene pairs coding a and b chains: HLA DR, DP, DQ
HLA DR: a chain is monomorphic, additional gene for b chain
Molekula HLA I. třídy složena z 1 variabilního těžkého alfa řetězce tvořeného 3 doménami a nekovalentně vázaného nepolymorfního beta2-mikroglobulinu (kódovaný mimo MHC). Domény alfa 1 a 2 tvoří vazebné místo pro peptidy dlouhé 8-10 AK. Do této třídy je zahrnuto asi 20 genů, z nichž nejdůležitější jsou geny HLA A, B, C.
Molekula HLA II. třídy je heterodimerní, složena z řetězců alfa a beta, které jsou kódovány dvěma geny. Tvoří vazebné místo pro peptidy dlouhé AK pocházející z extracelulárních antigenů. Jsou rozpoznávány CD4+ lymfocyty.

7. Polymorphism HLA locus Antigenic variants DNA variants HLA-A 25 83
HLA-B 53
186
HLA-C 11 42
HLA-DR (only b chain) 20
221
HLA-DQ (a and b chains) 9 49
HLA-DP (a and b chains) 6 88
Clinical genetics, 2001
antigenic variants (specificities) – due to differences in amino acid composition in a or b chain, determined by serology
DNA variants – in HLA alleles defined by serology were found further variations in DNA sequence
Example: HLA B27 allele is serologically unique, however 12 different variations in nucleotide sequence were found
V jednotlivých lokusech HLA-A,B,C,DP,DQ,DR bylo rozpoznáno množství odlišných antigenních variant. Tato tab ukazuje složitost a velký polymorfismus systému. Podle tradičního systému HLA nomenklatury byly různé alely navzájem odlišeny serotypizačně na základě odlišností ve struktuře alfa nebo beta řetězců (kde se rozpoznává Ag). Tak jak byly postupně identifikovány a sekvenovány další geny odpovědné za kódování antigenů I. a II.třídy, počet alel se enormně rozšířil. To znamená, že u alel původně serologicky definovaných bylo možno zjistit, že jsou složeny ze dvou nebo více alel, protože byly zjištěny varianty v DNA sekvenci.

8. Nomenclature of HLA system
HLA A*0101
locus serologic specificity specific allele defined by nucleotide sequencing
Example:
HLA A*0101, HLA A*0102 – same serologic specificity A1 differing in nucleotide sequence
HLA DRB1*0401
class subtype chain a/b number marking particular gene
serologic specificity specific allele
labelling w = working labelling
Písmeno A určuje lokus. První 2 číslice po hvězdičce informují o odpovídající serologické specifitě, která je zde A1. Poslední 2 číslice označují specifickou alelu určenou nuleotidovou sekvenací.
K označení molekul HLA II. třídy se používají 3 písmena. První označuje třídu, druhé rodinu a třetí alfa nebo beta řetězec molekuly HLA II. Následují číslice označující kokrétní gen, za hvězdičkou, stejné jako u HLA I. Jeli do označení zahrnuto písmeno w, znamená to, že se jedná o dočasné pracovní označení.

9. Polymorphism and inheritance of HLA haplotypes
high polymorphism number (not all!) causes variability in structure of surface HLA proteins
HLA alleles transmitted together like haplotypes
each parent has 2 expressed haplotypes
child will have one or another → 25% chance exists, that two siblings will have identical HLA haplotype as one of the parents
AB + CD → AC / AD / BC / BD
high variability in profile and frequence of HLA variants
example: HLA A2 most frequent in all populations
HLA A24 in Caucasians, not in afro-Americans and Asians
ethnically different distribution of particular HLA alleles and haplotypes
HLA genes are so closely linked that they move as a unit.
HLA alely jsou na daném chromozómu tak těsně vázány (sousedící geny), že jsou přenášeny společně jako haplotypy, tj. bloky genů mezi kterými pouze vyjímečně dochází ke crossing-overu (rekombinaci). Tyto alely jsou kodominantní, každý rodič má 2 exprimované haplotypy a předává jeden nebo druhý každému svému dítěti. Výsledkem je, že rodič a potomek sdílejí pouze jeden haplotyp a existuje tedy 25% šance, že dva sourozenci zdědí stejný haplotyp od jednoho z rodičů.
Haplotyp = sada HLA genů na 1 chromozómu

10. Incompatibility in Tx can lead to:
graft failure
role of HLA-A, -B, -C, -DR mismatches, total number of disparities influences the risk of graft failure
GvHD development
mismatches in HLA class I and/or II increase risk of aGvHD
decreased survival
mismatches in HLA-A, -B, -C, -DR but not -DQ, -DP decrease survival according to U.S. study
outcome differs according to individual studies

11. HLA typing Serotyping identification of HLA class I and II
discrimination of protein molecules on the basis of diversity in antigenic characteristics
using typing antisera panel (commercial trays), blood of multiparous women (1 father) – serum contains sufficient amount of antibodies against HLA molecules of foetus inherited from the father
very laborious procedure
less time-consuming than genotyping
certain degree of inaccuracy
Multiparous=rodivší vícekrát
Přesnost v HLA testování je velmi důležitá pro výsledek Tx. To platí zejména v případě nepříbuzných dárců.
Klasický přístup identifikuje konkrétní HLA molekuly, tj. proteiny, kde k odlišení slouží antigenní rozdíly, které jsou podmíněny unikátním složením AK v polymrofní části molekuly HLA. Používají se typizační séra, jejichž základním zdrojem je krev matek..
Pokud je k dispozici dostatečně velký panel sér, je možné určit expresi konkrétních HLA molekul I.třídy na T buňkách testovaného člověka pomocí mikrocytotoxického testu. Barvivo=ethidium bromid
K průkazu HLA molekul II.třídy je nutné mít B lymfo testovaného člověka, testují se HLA DR, DQ

12. HLA typing Routine typing of HLA class I:
Serotyping
Routine typing of HLA class I:
120 typing sera in microtitration plate
tested T lymphocytes are added, after incubation complement is added
positivity = serum antibodies bind to T lymphocytes, lysed by complement
evaluation using fluorescent microscope (dye binding to DNA in lysed cell)
Routine typing of HLA class II:
60 typing sera in panel
tested B lymphocytes are added, microcytotoxic test
HLA DR, DQ testing

13. HLA genotyping Clinical scheduling usually: DNA (genotyping)
using PCR and specific primers for individual allele, DNA isolation from blood
2 approaches:
low resolution – identification of broad families of alleles that cluster into serotypes („2-digit typing“, e.g. A*02 = A2 in serology)
high resolution – identification of the individual alleles within each serotype („4-digit typing“, e.g. A*0201)
more time-consuming
simple method, easy automatization
more sensitive method
Example: serotyping defines A*02, another 64 known alleles (A* )
genotyping defines A*0201 allele
Clinical scheduling usually:
HLA class I serotyping, HLA class II genotyping
Genotypizace již známých alel, kde známe sekvenci. Kde se objeví nové alely, je nutno nejdříve určit sekvenací genovou sekvenci, aby bylo možno urcit specificke primery a detekovat tak novou alelu! Např. v Africe. Mnoho Evropanů nebo Japonců bylo uz otestovano, testovani pribuznych.
Příklad: serotypizací se určí, že se jedná o serotyp A*02, má dalších známých 64 alel, které se dál dourčí genotypizací.

14. HLA typing - example Serotyping defines individual serotype:
A1,A3,B7,B8,DR3,DR15(2),DQ2,DQ6(1)
Genotyping specifies HLA phenotype in individual:
A*0101, *0301, Cw*0701,*0702, B*0702,*0801,
DRB1*0301,*1501, DQA1*0501,*0102, DQB1*0201,*0602
composed from 2 haplotypes from the parents:
A*0101 : Cw*0701 : B*0801 : DRB1*0301 : DQA1*0501 : DQB1*0201
(by serotyping A1-Cw7-B8-DR3-DQ2)
A*0301 : Cw*0702 : B*0702 : DRB1*1501 : DQA1*0102 : DQB1*0602
(by serotyping A3-Cw7-B7-DR15-DQ6)

15. HLA typing of blood relatives
Typing of patient and related donor
HLA-A, -B, -DR typing of two digits behind * mostly sufficient for identification of maternal and paternal haplotypes
confirmation of genotypic identity for the whole set of HLA genes (A,B,C,DR,DP,DQ) on both chromosomes = match 12/12
HLA-DP usually not tested – match 10/10
Asterisk=hvězdička
Pokud dojde k potvrzení genetické identity ve všech testovaných HLA genech na obou chromozómech, jedná se o shodu 12 z 12. Běžne v klinické praxi se však HLA-DP netestuje, takže shodný dárce se bude shodovat v 10 genech z 10.

16. HLA typing of blood relatives
IHBT, National reference laboratory for DNA diagnostics Department of HLA analysis
genotyping always with indication for HSCT, concurrently blood taking from primary blood relatives (siblings, parents, eventually children of the patient)
standard typing of HLA-A, -B, -DRB1 on the level of allele groups (low resolution) and identification of both haplotypes
= serotyping of HLA class I and genotyping of HLA class II - „2-digits“ typing
unclarity in haplotype identification: genotyping of individual alleles (high resolution, „4-digits“ typing)
Institute of hematology and blood transfusion.

17. Primary sample submission form for HLA genotyping genotypizaci

18. After determination of match/mismatch with relatives:
HLA-identical related donor in close family found
(i.e. sibling, parent)
blood taking for confirmatory examination, low resolution genotyping in loci:
HLA-A,-B,-C,-DRB1,-DQB1
(prior to starting conditioning regimen before Tx)
HLA-identical related donor in close family not found
searching in extended family - uncle, cousin... (HLA-A,-B,-DRB1 low resolution) or indication for unrelated HSCT (registry searching)
after finding the donor:
confirmatory examination by high resolution genotyping of loci:
HLA-A,-B,-Cw,-DRB1,-DQB1
Pokud je nalezen HLA shodný dárce v úzké rodině, tj. sourozenec nebo rodič, provedou se další odběry pro potvrzení typizace. Provádí se genotypizace na úrovni určení alelických skupin nízkým rozlišením v lokusech… a to před zahájením přípravného režimu před Tx.
Pokud v úzké rodině vhodný dárce nalezen není, indikuje se hledání v širší rodině, tím se myslí třeba stýc, teta, sestřenice apod., u kterých se genotypizačně určí lokusy HLA-A,-B,-DRB1 s nízkým rozlišením. Druhá možnost je pak indikace k nepříbuzenské Tx a zahájí se hledání v národním nebo zahraničních registrech dobrovolných dárců. Po nalezení dárce se opět provede konfirmační vyšetření.

19. HLA typing of unrelated donors
has to be typed: HLA- A*,B,Cw* , DRB1* a DQB1*
matching degree expressed as a 10/10, 9/10, 8/10 match
optional examination of genes DPB1*, DRB3*-5* or DQA1*
when several matched donors identified (also match in: AB0, age, sex, CMV status)
match evaluated according to results of „4-digits" typing
pair - DRB1*1101 vs. DRB1*1103 mismatched
HLA mismatch preferences for possible donor choice:
Cw*>A*B*,DQB1*>DRB1
Cw* the most accepted mismatch, DRB1 least accepted mismatch
non-HLA mismatches (blood group, CMV) can influence the choice of the donor more than HLA mismatch hierarchy, see the example:
V případě HLA typizace nepříbuzných dárců se musí se vyšetřit geny:.., tj. 5 základních lokusů
Neshody v polymorfismu intronů či v tichých mutacích ("silent mutations"), tedy "číslo" nejsou za neshody považovány. Pár s touto úrovní neshod je tedy považován za kompatibilní v dané alele (genu). Příklad: Pár - B* vs. B* je považován za shodný v tomto genu.
Hierarchií nebo preferencemi u HLA neshod u nepříbuzného páru rozumíme hierarchii důležitosti shody u hodnocených HLA genů. Tedy vlastně jaké neshody jsou více a které méně akceptovatelné v případě možnosti výběru z více 9/10 či 8/10 shodných párů nepříbuzných párů.
Přes trvající kontroverze jsou neshody v I. třídě HLA a DQB1* genu preferovány před neshodami v DRB1* genu.
Celková preference (hierarchie) neshod je následující: Cw*>A*B*,DQB1*>DRB1 (geny vyjádřeny v pořadí od nejvíce do nejméně akceptovatelné neshody).

20. HLA typing of unrelated donors
Example
patient:
A*0201, B*3501,1501, Cw* 0401,0303… CMVneg, BG Aneg
donor #1:
A*0201, B*3503, 1501, Cw*0401, 0303, CMVneg , BG Aneg
donor #2:
A*0201, B*3501, 1501, Cw*0401, 0304, CMVpos, BG Bpos
-> donor #1 is preferred despite of HLA-B gene mismatch (CMV +ABO compatibility)

21. Tx from HLA-identical sibling
Patient: M/4, MDS
graft: BM
donor: sister weight: 36 kg age: 9
Recipient Donor
Blood group Rh Rh +
HLA
A *0201 *6801
B *3501 *3906
Cw *0401/04 * 1203
DRB1 *0101 *0801
DQB1 *0501 *0402
DPB1
A dtto
B dtto
Cw dtto
DRB1 dtto
DQB1 dtto
DPB1 dtto
Gronka
Match 10/10

22. Tx from unrelated donor
Patient: M/16, pre-B ALL CR2
graft: PBSC
Donor code:
DERKS
Sex: F
weight: 87
age: 40
Recipient
Donor
Blood group A Rh - +
HLA
*0201
*2402
*0301 B
*2705
*4101 Cw
*0202
*1602
*02
*17
DRB1
*0101
*0404
*0101/17-19
DQB1
*0501
*0302
*04
DPB1 *
Match 7/10
Malincik

23. Searching in donor registries Czech republic has 3 registries
Czech Stem Cell Registry (IKEM, Prague)
Cord Blood Bank (IHBT, Prague)
Czech National Marrow Donor Registry (CNMDR, Pilsen)
established in 1992 in Pilsen by Bone Marrow Transplant Foundation, 7 donor centers created in CR
1993 cooperation via Bone Marrow Donor Worldwide located in Leiden, Netherlands
1997 cooperation contract with the American National Marrow Donor Program
until 1998 funded entirely by Bone Marrow Transplant Foundation
2000 concluded mutual contracts with health insurance companies – cover some of the expenses in conjunction with active search for the most suitable donors from the Registry as well as the expenses connected with their more detailed HLA examination
CNRDD byl založen v roce 92 Nadací pro transplantaci kostní dřeně a postupně byla vytvořena síť 7 dárcovských center v celé ČR, které byly ochotny spolupracovat. V roce 93 byla navázána mezinárodní spolupráce prostřednictvím BMDW se sídlem v holandském Leidenu. V roce 1997 pak podepsal smlouvu o spolupráci s americkým Národním programem dárců dřeně.
V průběhu roku 2000 došlo k uzavírání vzájemných smluv se zdravotními pojišťovnami, které začaly poprvé hradit některé náklady spojené s aktivním vyhledáváním nevhodnějších dárců z registru pro konkrétní pacienty a náklady spojené s jejich podrobnějším HLA vyšetřováním.
V ČR máme registry dva (Centrální registr dárců dřeně, Plzeň, a Národní registr dárců KD, Praha, celkem registrují více než dvacet tisíc dárců).

24. http://www.kostnidren.cz/registr/ http://www.czechbmd.cz/
Donor centres in CR
Brno
České Budějovice
Hradec Králové
Most
Olomouc
Ostrava
Plzeň
Praha
Ústí nad Labem
cooperation with other donor centres in regions

25. Global Donor Registry Bone Marrow Donor Worldwide
14,093,962 (13,684,277 donors and 409,685 CBU's)
(last updated: 22-Feb-2010)
60 bone marrow registries from 44 states
+ 42 cord blood registries from 26 states
Germany cca 3,7 million donors, CR cca
USA – 14 registries, cca 5,5 million donors
CBU=cord blood unit

26. Anthony Nolan Trust first bone marrow donors registry
established in 1974 in Great Britain (Westminster Children‘s Hospital)
by Anthony Nolan‘s mother (WAS, 1971 – 1979)
presently one of the biggest registries in the world
Vědělo se, že jedinou možnou léčbou je transplantace kostní dřeně od kompatibilního dárce. Jenže tehdy ještě žádné registry neexistovaly, neporváděly se HLA typizace, takze hledat darce bylo jako hledat jehlu v kupce sena. Shirley zacla pracovat na systemu, který by analyzoval tkanovy typ jedince a zaznamenal se v prijatelne forme se vsemy dalsimi informacemi o darci. Anthony zemrel, aniz by byl darce nalezen.