1. 系 统 实 验 之 二 T 淋巴细胞功能测定 付海英fuhaiying612@yahoo.com.cn

2. 实验流程实验流程 1W 1. 双向免疫扩散试验③ 2. 酶联免疫吸附试验 ( ELISA ) ④ 1. 双向免疫扩散试验③ 2. 酶联免疫吸附试验 ( ELISA ) ④ OVA (1mg/ml)+CFA 免疫小 鼠腹腔内注射 500 µl OVA+CFA 加强免疫 小鼠 500 µl ① 摘眼球取血 无菌取脾和胸腺② 摘眼球取血 无菌取脾和胸腺② 分离血清② 2W 取脾和胸腺② 淋巴细胞转化试验② 生理盐水（ 500 µl) 免疫 小鼠腹腔内注射 生理盐水（ 500 µl ) 免疫 小鼠腹腔内注射 生理盐水加强免疫小 鼠 500 µl ① 2W After 1W 对照组实验组 抗体效价 增殖功能

3. 实验内容  小鼠摘眼球取血、 分离血清  淋巴细胞转化试验

4. 教学要求  掌握小鼠血清的分离  掌握淋巴细胞转化试验 的基本原理及基本操作

5. 淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test)  原理  检测方法  操作步骤  应用

6. 实验分组及材料  器材 1. 酒精棉球若干 2. 无菌纱布块 1 块 / 组 3. 无菌平皿 1 块 / 组 4. 无菌吸头（大、中、小） 4 盒 /room 5. 无菌 96 孔培养板 1 块 / 组 6. 可调微量加样器 4 套 /room 7. 细胞计数板 1 套 / 组 8. 显微镜 1 台 / 组 9.EP 管若干 10. 眼科剪、小镊子 4 套 /room 11. 细胞培养箱（ 37 ℃ 5%CO 2 )  器材 1. 酒精棉球若干 2. 无菌纱布块 1 块 / 组 3. 无菌平皿 1 块 / 组 4. 无菌吸头（大、中、小） 4 盒 /room 5. 无菌 96 孔培养板 1 块 / 组 6. 可调微量加样器 4 套 /room 7. 细胞计数板 1 套 / 组 8. 显微镜 1 台 / 组 9.EP 管若干 10. 眼科剪、小镊子 4 套 /room 11. 细胞培养箱（ 37 ℃ 5%CO 2 ) 12. 酶标仪 13. 离心机 2 个 /room 14. 超净台 2 个 /room  动物及试剂 1. 小鼠 2 只 / 组 (NS,OVA) 2. 培养液（ IMDM) 无 FCS 100ml/room 3. 培养液（ IMDM)20%FCS 30ml/room 4.ConA （ 2.5,5,10µg/ml) 各 1.5ml/tube 5. 白细胞计数液（ 2% 冰醋酸） 2 瓶 /room 6.MTT （ 5mg/ml) 1.5ml/room 7. 二甲亚砜（ DMSO) 5ml/ 组 12. 酶标仪 13. 离心机 2 个 /room 14. 超净台 2 个 /room  动物及试剂 1. 小鼠 2 只 / 组 (NS,OVA) 2. 培养液（ IMDM) 无 FCS 100ml/room 3. 培养液（ IMDM)20%FCS 30ml/room 4.ConA （ 2.5,5,10µg/ml) 各 1.5ml/tube 5. 白细胞计数液（ 2% 冰醋酸） 2 瓶 /room 6.MTT （ 5mg/ml) 1.5ml/room 7. 二甲亚砜（ DMSO) 5ml/ 组 分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏

7. 免疫血清分离过程 摘眼球取血 RT for 2hrs Rotation 3000rpm for 20min Transfer serum to a new EP Double diffusion Store at 4 ℃ ELISA 1.5ml EP

8. 实验步骤  单细胞悬液的制备：   小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。   于超净台内取出脾和胸腺组织 ( 各 1/2) ，分别放入预先盛有 2ml IMDM 培养液的平皿内。   将 3-4 层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻 压组织，将其捣碎。然后用 1000 µ l 加样器隔着纱布将细胞悬液吸出， 放入 1.5ml EP 管中。  细胞计数：   取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20 µ l ，加到盛有 980 µ l 计数液 的 EP 管中，在显微镜下计数，计数方法见后。   调细胞浓度至 1×10 7 /ml ，所需量为 1.5ml ，设需要的细胞悬液体积 为 Aml, 可按公式： ?/ml×A=1.5×1×10 7 NOTE: 在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。

9. 细胞计数板  查出四个大方格的总细胞数 (X)  算出每个大方格的细胞数： Y=X/4  每个大方格的体积为 V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm 3 =10 -4 ml  制备的细胞悬液的细胞浓度（ /ml)=Y ×10 4 × 稀释倍数 (50) 4

10.   细胞培养： 1. 1. 按图所示加板。 按图所示加板。   将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 37 ℃ 5%C0 2 培养箱 中，培养 48 小时。   MTT 掺入：（隔一天 下午 2:00 ）   在终止培养前 2 小时，在显微镜下观察细胞转化情况。   每孔内加入 MTT （ 5mg/ml) 10 µ l ，加完后轻轻搕板，使 MTT 和细胞混匀。   在 37 ℃ 5%C0 2 培养箱中继续培养 2 小时，然后离心 2000rpm ， 5min ，轻 轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。   加入 100 µ l 二甲亚砜（ DMSO) ，将颗粒溶解。 （隔一天 下午 4:00 ）   结果测定：   结果测量：用酶标仪测定光密度值： A570nm （用空白孔调零），记录结 果。   结果判定： SI （刺激指数） =Con A 刺激孔 A 值 / 对照孔 A 值

11. 预习内容  单克隆抗体的制备（理论 P70 ，实验 P106 ）  双向免疫扩散（理论 P241 ，实验 P116 ）

12.   八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺   每孔加入 100 µl 调好的细胞悬液   1-3 孔加入 10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl   4-6 孔加入 2.5 µg/ml 的 Con A, 100 µl   7-9 孔加入 5 µg/ml 的 Con A, 100 µl   10-12 孔加入 10 µg/ml 的 Con A, 100 µl NOTE:ConA 用 10%FCS-IMDM 培养液配制 1-34-67-910-12A spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5µg/ml spleen cell+ ConA 5µg/ml spleen Cell+ ConA 10µg/ml B spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5µg/ml spleen cell+ ConA 5µg/ml spleen Cell+ ConA 10µg/ml C thymus cell+ 10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5µg/ml thymus cell+ ConA 5µg/ml thymus Cell+ ConA 10µg/ml D thymus cell+ 10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5µg/ml thymus cell+ ConA 5µg/ml thymus Cell+ ConA 10µg/ml N.S. OVA N.S. OVA 加样方法 返回

13.   八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺   每孔加入 100 µl 调好的细胞悬液   1-3 孔加入 10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl   4-6 孔加入 2.5 µg/ml 的 Con A, 100 µl   7-9 孔加入 5 µg/ml 的 Con A, 100 µl   10-12 孔加入 10 µg/ml 的 Con A, 100 µl 1-34-67-910-12A spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5µg/ml spleen cell+ ConA 5µg/ml spleen Cell+ ConA 10µg/ml B spleen cell+ 10% IMDM spleen cell+ ConA 2.5µg/ml spleen cell+ ConA 5µg/ml spleen Cell+ ConA 10µg/ml C thymus cell+ 10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5µg/ml thymus cell+ ConA 5µg/ml thymus Cell+ ConA 10µg/ml D thymus cell+ 10% IMDM thymus cell+ ConA 2.5µg/ml thymus cell+ ConA 5µg/ml thymus Cell+ ConA 10µg/ml N.S. OVA N.S. OVA 加样方法