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Proteínas de fusión 2 problemas principales con la expresión de proteínas foráneas –Degradación –Purificación.

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1 Proteínas de fusión 2 problemas principales con la expresión de proteínas foráneas –Degradación –Purificación

2 Proteínas de fusión Degradación –produce un nivel bajo de expresión –es dificil la purificación de la proteína deseada Una solución para la degradación –Unir la proteína target a una proteína celular estable (tag o carrier)

3 Proteínas de fusión Proteína de fusión (a nivel DNA o genes) –Región que codifica una proteína celular fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target –Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión

4 Proteínas de fusión Carrier o tag en el extremo -NH2 o –COOH de la proteína - un dominio con actividad catalítica - un dominio antigénico - una señal peptídica topogénica protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés

5 Proteínas de fusión stable genegene of interest MET... LEU ARG THR MET VAL ILE... End ATG... GTG CGA ACC ATG GTG ATC... TAG Nco I Note: translation stop of cellular gene must be removed Note: reading frame of fusion protein must be contiguous

6 Proteínas de fusión Clivado por proteasas –Clivan una corta y definida secuencia de aa –La secuencia de clivado para la proteasa entre el gen carrier y el gen de interés fusion partnergene of interest protease cleavage sequence

7 Sitio de clivado para el Factor Xa

8 Purificación de proteínas de fusión La proteína de fusión se une a una molécula pequeña o anticuerpo (Ab) La molécula pequeña o Ab pueden estar unidos a una matriz inerte La proteína de fusión se unirá, las otras no La proteína purificada se eluirá de la columna

9 Purificación por cromatografía de afinidad

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11 Proteínas de fusión A veces la sobreexpresión puede reducir la cantidad de proteína recuperada –La proteína forma agregados insolubles: Cuerpos de inclusión –La formación de agregados puede deberse a un plegamiento incorrecto

12 Proteínas de fusión Soluciones a la formación de cuerpos de inclusión proteína de fusión con tioredoxina (soluble) Proteína de fusión con péptido señal, por ej. de la fosfatasa alcalina (periplasma) Tratamiento con agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidinio)

13 pRSET Expression Vector The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers: High-level expression from the bacteriophage T7 promoter T7 gene 10 sequence to provide protein stability N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis

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