1. Mucopolysaccharidosis and adenovectors (CAV)
Anna Borroso
Gianmarco Rinaldi
Petra Tomassini
Silvia Santopolo
Terapia genica /4/2012 1 1

2. The mucopolysaccharidoses (MPSs) are lysosomal storage disorders caused by the accumulation of glycosaminoglycans in the lysosomes that leads to a cascade of multisystemic disease manifestations. The disease is caused by mutations in one of the enzymes that catalyze GAGs degradation.
The most severe forms of MPSs involve progressive degeneration of the Central Nervous System with consequent cognitive impairment. Current therapies are targeted to the replacement of the defective enzyme, but the impossibility of therapeutic molecules or vectors to cross the Blood Brain Barrier limits the treatment to the non- neural symptoms.
The aim of new emerging strategies is the reduction of the substrate production, rather than promote its degradation. According with this strategy, we propose to inhibit the gene expression of the enzymes involved in the first steps of GAG biosynthesis using shRNAs expressed by an helper-dependent canine adenoviral vector. Our aim is to effectively treat cognitive impairment, which is still now uncured.
Le mucopolisaccaridosi sono malattie metaboliche dovute ad accumulo lisosomiale causato dal deficit degli enzimi che catalizzano la degradazione dei glicosaminoglicani.
Alcune forme, le più gravi, presentano danni al CNS hanno pertanto un decorso neurodegenerativo.
Questo è l'aspetto più difficile da trattare soprattutto a causa della presenza della barriera ematoencefalica che non permette il raggiungimento delle varie aree del CNS da parte delle varie molecole o vettori terapeutici.
Il principale approccio delle terapie attualmente in studio punta a ripristinare l'attività enzimatica mancante.
Noi proponiamo una nuova terapia genica che coniughi la nascente strategia di ridurre invece la sintesi di nuovo substrato, utilizzando siRNA che riducano l'espressione di enzimi coinvolti in questa sintesi.
Il tutto mediante l'uso di un vettore CAV, in modo tale da puntare principalmente a riuscire a trattare efficacemente il CNS.
Lo scopo principale è dunque quello di colpire l'aspetto neurodegenerativo della MPS I, per il quale ancora non esiste nessuna terapia.
Abstract 2 2

3. Mucopolysaccharidosis
- Lysosomal storage disorder
- Deficiency of one of the enzyme involved in degradation of GAGs.
- Seven distinct clinical types(I-II-III-IV- VI-VII-IX)
- Autosomal recessive disorder (the exception is MPS II that is X-linked)
- Affect multiple organ systems and lead to organ failure
- Cognitive impairment
- Reduced life expectancy
Le mucopolisaccaridosi sono un gruppo di malattie metaboliche dovute ad accumulo lisosomiale causato dal deficit degli enzimi che catalizzano la degradazione dei glicosaminoglicani (mucopolisaccaridi). Il difetto dei vari enzimi, porta ad un accumulo di molecole diverse a causa della mancata degradazione del dermatansolfato, dell’eparansolfato, del cheratansolfato, del condroitinsolfato e dell’acido ialuronico, singolarmente o in combinazione. L’accumulo di questi mucopolisaccaridi impedisce l’esocitosi dei lisosomi e altera diversi pathway metabolici, causando quindi delle gravi disfunzioni nelle cellule, nei tessuti e negli organi(organomegalia). Sono note sette forme cliniche distinte di MPS (I-II-III-IV-VI-VII-IX) ognuna dovuta ad un deficit enzimatico diverso. Sono tutte dovute a mutazioni autosomiche recessive, ad eccezione della Mucopolisaccaridosi II (Sindrome di Hunter) che e’ invece X-linked. Sebbene con diversi gradi di gravita’, tutte le mucopolisaccaridosi condividono molti sintomi clinici. Hanno un decorso cronico e progressivo e sono caratterizzate dal danneggiamento di diverse funzioni vitali come la vista e l’udito, malattie cardiovascolari, broncopatie ostruttive dovute all’assottigliamento delle trachea e all’ingrossamento di corde vocali e lingua, rigidita’ articolare e displasie scheletriche. Il sistema nervoso centrale e’ fortemente danneggiato nelle forme piu’ acute di Mucopolisaccaridosi I H (Sindrome di Hurler), Mucopolisaccaridosi II (Sindrome di Hunter) e Mucopolisaccaridosi III in tutte le sue varianti (Sindrome di SanFilippo) nelle quali si puo’ riscontrare un grave ritardo mentale.
Referenze:
Jermale A.Sam et al 2011
Scriver C et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Eighth Edition
Joseph Muenzer 2011
Thomas J. A. Lehman et al 2011
Vassili Valayannopoulos1 and Frits A. Wijburg 2011
Mucopolysaccharidosis 3 3

4. Site of the enzyme deficiencies4 4

5. MPS I - autosomal recessive - 1:100 000 frequence - 3 type:
- Hurler Syndrome
- Hurler-Scheie Syndrome
- Scheie Syndrome
- deficient activity of α-L-iduronidase
(IDUA) (chromosome 4)
- more than 100 different mutations
La nostra attenzione si è focalizzata sulla sindrome di Hurler, sia per la sua gravità, sia perché colpisce il sistema nervoso centrale e ad oggi non esistono cure.
Negli individui affetti da sindrome di Hurler (MPS IH) i sintomi iniziali di disfunzioni neurologiche sono evidenti fino dalla prima infanzia. La mucopolisaccaridosi I è dovuta all’assenza dell’attivita’ enzimatica di α-L-iduronidase (IDUA), che porta ad un difetto nella degradazione dei glicosaminoglicani (GAGs) ,detereminando l’accumulo lisosomiale di eparan solfato e dermatan solfato in molti tessuti del corpo. In particolare, nel sistema nervoso centrale, delle analisi istopatologiche hanno mostrato la presenza di lisosomi con depositi di GAG nei neuroni, nella glia e nelle cellule perivascolari. La mucopolisaccaridosi I e’ stata classificata in tre sindromi diverse clinicamente, sulla base della gravita’ e della velocita’ di progressione dei sintomi. La sindrome di Hurler (MPS IH) è la forma piu’ severa, in cui i sintomi appaiono nell’infanzia e sono sempre molto gravi, tanto che la vita media di pazienti non trattati è 6,8 anni. Le sindromi di Scheie (MPS IS) e di Hurler-Scheie (MPS IHS) sono le forme meno gravi in cui il ritardo mentale o non è presente, o è presente in forma lieve. La frequenza della malattia è di 1: e la sua variabilità sia a livello genetico che fenotipico, rende la diagnosi davvero difficoltosa. Attualmente la diagnosi viene effettuata utilizzando tecniche come l’elettroforesi bidimensionale e il blu dimetilene per separare e fare una stima della concentrazione dei glicosaminoglicani urinari. Il problema fondamentale pero’ e’ che le mucopolisaccaridosi I è una malattia progressiva che comincia a manifestarsi fin dai primi mesi di vita, e prima la si diagnostica, più si hanno speranze di effettuare una terapia efficace. Per questo motivo è stata messa a punto una diagnosi prenatale che viene routinariamente svolta su colture cellulari ottenute dal liquido amniotico o dalla biopsia dei villi corionici usando gli stessi saggi enzimatici impiegati nelle colture di fibroblasti. Sono state incontrate alcune difficoltà nella diagnosi prenatale della Mucopolisaccaridosi I, a causa del basso livello di alfa-L-iduronidasi nei villi corionici, ma il problema può essere risolto con particolari accorgimenti.
Referenze
Kristin D’Aco et al. 2011
Scriver C et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Eighth Edition
Nathalie Desmaris et al 2004
MPS I 5 5

6. Existing Therapies Strategy Mechanism Limits
Degradation of stored GAGs via restoration of enzyme activity
ERT, Enzyme replacement Therapy
CNS access across the Blood Brain Barrier;
Repeated administration.
HSCT, Hematopoietic Stem Cell Treatment
CNS access across the BBB
Gene therapy ,
Numerous eterogeneus different mutantions across the entire gene: it needs to be entirely substitueted
Immunogenicity of IDUA;
Diffusion of the vector into the brain;
Inibition of new GAGs synthesis
(substrate reduction therapy)
Inhibitors of enzymes involved in GAGs biosynthesis (Genistein)
Side Effects (e.g. decreased male fertility)
Gene Theray with siRNA: Inhibition of the expression of enzymes involved in GAG biosynthesis
Delivery
Le principali terapie disponibili per pazienti affetti da MPS I sono mirate a fornire l’enzima mancante (ERT).
Dai dati clinici la terapia risulta funzionante ma presenta una serie di svantaggi tra cui: la necessità di somministrare settimanalmente l’enzima; la possibile induzione di reazioni specifiche (IAR, Infusion Associated Reactions: rossore, mal di testa, febbre, sfoghi cutanei); e soprattutto l’incapacità dell’enzima di attraversare la barriera emato-encefalica, e dunque di agire a livello neuronale.
La HSCT (Hematopoietic Stem Cell Treatment), trattamento con cellule staminali ematopoietiche, sembra invece avere effetti positivi anche a livello neuronale, tuttavia i rischi di rigetto e quelli relativi all’intervento stesso sono piuttosto elevati.
Numerosi studi su topo mirano invece alla ricerca di strategie di terapia genica per l’introduzione nel paziente del gene wt tramite un vettore di espressione genica. La nostra attenzione si era posta però sul problema dell’immunogenicità di IDUA, riconosciuto come esogeno in quanto mancante nel paziente.
Fornire direttamente l’intero gene, sembra d’altronde l’unica strategia possibile in questo caso dal momento che le mutazioni che causano la patologia sono estremamente numerose ed eterogenee, e le poche che risultano più frequenti, sono tali da non poter esser trattate con strategie atte ad evitare l’introduzione dell’intero gene (come ad esempio quelle sviluppate per la correzione delle mutazioni dei siti di splicing).
Altri limiti riguardano la diffusione del vettore e la breve durata di espressione del gene trasdotto. Nuove terapie riguardano approcci volti non più a indurre la degradazione del materiale accumulato, fornendo l’enzima funzionante, ma piuttosto a ridurre la sintesi di nuovo substrato.
In questo senso risulta efficace, anche a livello neuronale, la Genisteina, una molecola appartenente al gruppo degli isoflavoni, che però sembra avere alcuni effetti collaterali, in particolare si comporta da fitoestrogeno causando per esempio infertilità maschile, e necessita di essere somministrata giornalmente.
L'approccio di riduzione del substrato si è però rivelato più che efficace.
Infatti, dopo trattamento con Genisteina, oltre ad ottenere una riduzione della sintesi di nuovi GAGs, è stato osservato che i livelli totali di GAGs nella cellula restavano costanti e si otteneva inoltre una riduzione nell'accumulo lisosomale di GAGs stessi.
I ricercatori che hanno condotto questi studi, hanno per questo ipotizzato una possibile regolazione a feedback della quantità di GAGs nella cellula.
Secondo questa ipotesi infatti, i GAGs verrebbero prodotti di continuo, e la loro degradazione servirebbe proprio a smaltirne l'eccesso.
In questo modo si spiegherebbe il fatto che riducendo la sintesi, non c'è più eccesso di GAGs ed ecco perchè non c'è più il bisogno di degradarli.
Seguendo questa promettente strategia di riduzione del substrato, uno studio più recente ha utilizzato invece piccoli RNA interferenti rivolti contro i trascritti degli enzimi coinvolti nelle prime fasi di sintesi di dermatan solfato ed eparan solfato (i due GAG accumulati nei lisosomi in pazienti MPS I).
compared to newborn larger animal models and newborn humans, neonatal mice are developmentally primitive and contain a relatively greater proportion of dividing stem cells, greater permeability of physiological barriers (e.g., blood–brain barrier), and a more naive immunological state
Existing Therapies 6 6

7. Therapeutic strategy to recover cognitive impairment
Reduction of GAG
accumulation throught
inhibition of their syntesis
use of siRNAs
use of Canine Adenoviral Vector
- low immunogenicity
- efficently trasduce neurons
Sono stati scelti, come enzimi target, XYLT1, XYLT2, GALTI, GALTII perchè è stato osservato che mutazioni che comportano la mancata produzione di tali enzimi, non portano a nessuna patologia: evidentemente l'assenza di questi enzimi, e tanto meno una loro diminuzione, non altera altri pathways.
I risultati ottenuti dall'utilizzo di questi siRNA, mostrano un'efficace riduzione della sintesi di GAGs. È importante notare che la riduzione deve essere tale da consentire però una produzione minima di GAGs, necessari alla normale vita della cellula.
L'obiettivo che ci proponiamo è di sperimentare una nuova terapia genica che coniughi la strategia di ridurre la sintesi di GAGs con l'uso di siRNA che riducano l'espressione di enzimi coinvolti in questa sintesi.
Il tutto mediante l'uso di un vettore CAV, in modo tale da puntare principalmente a riuscire a trattare efficacemente il CNS.
Lo scopo principale è dunque quello di colpire l'aspetto neurodegenerativo della MPS I, per il quale ancora non esiste nessuna terapia.
Il CAV presenta l’ulteriore vantaggio di non indurre risposte immunitarie (essendo xenogenico), di trasdurre preferenzialmente i neuroni ed è anche in grado di diffondersi nel CNS tramite il trasporto assonale retrogrado.
Objectives 7 7

8. 3rd generation CAV-2 multi-shRNA-GFP How to design the shRNAs 8 8
Proponiamo quindi di inserire in questo vettore, quattro sequenze codificanti per shRNA ottenuti dai siRNA contro XYLT1, XYLT2, GALTI, GALTII, in modo da colpire contemporaneamente più target, per ottenere una maggiore efficienza.
In questo vettore ogni shRNA ha un suo promotore (usiamo promotori U6 e H1 in quanto promotori per Pol III).
Scegliamo di utilizzare un vettore di terza generazione per evitare qualunque risposta immunitaria e in modo da avere più spazio a disposizione per il nostro costrutto. Questo tipo di vettore presenta soltanto le due ITR e il sito ψ. La regione E1, che codifica per proteine fondamentali per l’espressione degli altri geni precoci e tardivi del virus è essenziale per la replicazione del virus, le forniremo in trans in linee cellulari specifiche. Infine abbiamo aggiunto la GFP necessaria in fase di sperimentazione come controllo dell'avvenuta trasduzione delle cellule da parte del vettore, ma la poniamo sotto promotore inducibile in modo tale che, nella fase di sperimentazione in topo, possiamo esprimerla solo appena prima di sacrificare il topo stesso, evitando così eventuali effetti immunogenici. Dato che il nostro costrutto è piccolo e che il virus può incapsidare un genoma di una lunghezza pari al 75%-105% del genoma wt abbiamo messo al 5’ del nostro costrutto un IVS (introne) allo scopo di completare il DNA da incapsidare.
Il vettore è costruito nel seguente modo:
Clonazione del DNA del vettore sotto forma di plasmide
Amplificazione in E.coli
Purificazione del vettore
Linearizzazione per liberare il frammento fiancheggiante dalle due ITR
Trasfezione in una cellula helper
Dato che questi vettori sono completamente privi di geni virali, tutte le proteine devono essere fornite in trans. Ciò è ottenuto con la co-infezione delle cellule con un adenovirus in grado di replicarsi. Per evitare, però, l’incapsidamento del virus helper viene mutato o eliminato il gene ψ.
In dettaglio vengono usate cellule HEK293A (cellule embrionali renali umane), che contengono una copia dei geni E1 integrati stabilmente capaci di esprimere la ricombinasi, vengono trasfettate con il genoma linearizzato del vettore e infettate con un vettore di prima generazione che presenta ai lati di ψ due sequeze loxP. Nelle cellule il segnale ψ viene rimosso e quindi previene l’incapsidamento del genoma helper nei virioni.
3rd generation
CAV-2 multi-shRNA-GFP 8 8

9. primary cultures of neurons from
CAV-2 multi-shRNA-GFP
- Test cell vitality
- Test vector presence: light microscopy observation of GFP fluorescence
- siRNAs expression: Northern Blot
- mRNAs target levels: Real time PCR
- Target proteins levels: Western Blot
- Reduction of GAG biosynthesis: measurement of incorporation of 35S from a radioactive sodium sulfate into PG
- Level of GAG: Blyscan Assay
- siRNAs off-target effects: Microarray
primary cultures of neurons from
wt mice
Per prima cosa verifichiamo il funzionamento del nostro vettore.
Trasduciamo, col nostro vettore CAV-2 multi-shRNA-GFP, neuroni wt di topo e facciamo su queste cellule un test di vitalità per escludere eventuali probemi causati dal vettore stesso.
Al microscopio osserviamo poi la presenza di fluorescenza GFP nelle cellule per assicurarci dell'effettiva presenza del vettore e del suo funzionamento.
A questo punto è opportuno verificare che gli shRNA espressi dal vettore vengano effettivamente prodotti e processati correttamente dalla cellula nei rispettivi siRNA.
Si può fare a tale scopo un Northern Blot su lisato cellulare per rilevare la presenza dei siRNA terapeutici.
Sarà poi necessario fare una Real Time PCR per andare a dimostrare che l'azione di tali siRNA porta effettivamente alla riduzione nei livelli di mRNA target.
Un'ulteriore controllo potrebbe essere quello di fare un Western Blot per verificare che siano diminuiti anche i livelli degli enzimi tradotti a partire da quegli mRNA.
Si passa poi a dimostrare che in questo modo si ottiene effetivamente la riduzione della sintesi di GAG.
Per fare questo non si fa altro che misurare la quantità di 35S (fornito tramite una molecola dalla quale la cellula preleva lo S durante la sintesi di GAG) incorporato nei GAG di nuova sintesi.
Infine nel caso in cui il risultato sia positivo, sarà necessario verificare che però il contenuto totale della cellula in GAG sia rimasto invariato (per assicurare alla cellula il giusto apporto di GAG).
Esistono a tale scopo kit dedicati come il Blyscan Assay.
Un controllo opportuno è verificare che l'espressione di questi siRNA non abbia degli effetti off-target e quindi non alteri l'espressione di altri geni nella cellula.
A tale scopo effettuiamo un Microarray.
Experimental plan 9

10. primary cultures of neurons from
CAV-2 multi-shRNA-GFP
- Test cell vitality
- Test vector presence: light microscopy observation of GFP fluorescence
- siRNAs expression: Northern Blot
- mRNAs target levels: Real time PCR
- Target proteins levels: Western Blot
- Reduction of GAG biosynthesis: measurement of incorporation of 35S from a radioactive sodium sulfate into PG
- Level of GAG: Blyscan Assay
- siRNAs off-target effects: Microarray
- Reduction of the number of lysosomal inclusions: light microscopy
primary cultures of neurons from
MPS I mice
Nel caso in cui tutte le analisi precedenti abbiano esito positivo e quindi dimostrino l'efficacia del vettore CAV-2 multi-shRNA-GFP, si potrà passare allo step successivo, in cui andiamo a testare la validità di questo vettore su neuroni MPS I.
Più precisamente lavoriamo su neuroni di topo MPS I.
Ripetiamo tutte le analisi effettuate nei neuroni wt e nel caso in cui diano risultati soddisfacenti si può procedere all'osservazione al microscopio del numero e dell'aspetto delle inclusioni lisosomali, nella speranza di averne una riduzione, ovvero la scomparsa del fenotipo malato della cellula.
1)fluorometric assay based on the conversion of 4-methylumbelliferone α-L-iduronide substrate into fluorescent product
2)DKCre Cell infettate con CAV-IDUA-GFP
Experimental plan 10 10

11. CAV-2 multi-shRNA-GFP
- Test vector diffusion: GFP fluorescence observation in brain sections
- Target mRNAs levels: Real Time PCR
- Target proteins levels: Western Blot
- Reduction of GAG storage: light microscopy observation of number and aspect of lysosomal inclusions
- Absence of desease synthomps: cognitive test
- Eventual IFN siRNAs response: IFN target genes levels of expression
MPS I newborn mice
Nell'ipotesi in cui tutti gli studi fin'ora descritti diano esito soddisfacente, si può passare ad un ulteriore livello di studio in vivo su topo MPS I neonato.
Iniettiamo il vettore con iniezione ICV (intra-cerebro-ventricular), che secondo studi precedenti risulta essere un buon sito di iniezione di vettori virali in topo, per favorirne la loro diffusione in tutto il cervello.
Dovranno essere saggiate diverse concentrazioni di vettore iniettato, alla ricerca di quella più funzionale.
Topi così trattati verranno sacrificati a diversi intervalli di tempo, per verificare prima l'efficacia del vettore a breve termine, ed eventualmente anche a lungo termine.
Appena prima di sacrificare il topo attiveremo l'espressione di GFP fornendo doxiciclina.
Andremo quindi per prima cosa a verificare la presenza e la localizzazione di fluorescenza GFP in sezioni di cervello di topo.
In questo modo avremo un'idea, dell'avvenuta trasduzione del vettore e della sua diffusione nelle diverse aree del cervello che dovrebbe essere favorita dalla proprietà del CAV di essere trasportato attraverso il sistema di trasporto assonale retrogrado.
Poi su omogenati di cervello di questi topi verranno effettuate analisi di Real Time e Western Blot per verificare l'abbassamento dei livelli rispettivamente di mRNA ed enzimi target dei siRNA terapeutici.
Al microscopio si osserverà poi l'effettiva diminuzione di inclusioni lisosomali da accumulo di GAG tipici dell'MPS I.
Nel caso si ottenga riscontro positivo, si potrà sottoporre topi vivi trattati allo stesso modo, a test cognitivi per dimostrare l'eventuale scomparsa dei sintomi della malattia.
Un'ultimo controllo opportuno consiste nel verificare che i siRNA terapeutici non inducano risposte infiammatorie.
Per fare questo basterà rilevare che, in seguito al trattamento, non ci sia un aumento di espressione di geni target dell'IFN (sostanza prodotta in seguito a infiammazione).
Homogeneates from brain sections of 3days, 1 week, 2 weeks old mice
Experimental plan 11 11

12. Pitfalls and solutions
Necessity of an early
treatment in newborn
patients
Future human trial
Necessity of a
prenatal diagnosis
Necessity of a long-therm expression of the shRNA
(e.g.: hybrid vector able to integrate in the host genome)
Pitfalls and solutions
MPS I mice (IDUA-/-): provided by Dr. E. F. Neufeld, USA
Blyscan Glycosaminoglycan Kit: 120 Assays 478 €
Kit Microarray: 500€
Anticorpi vari: 500€
Strumentazioni e varie: €
Una simile terapia, se dovesse rivelarsi efficace, andrebbe comunque effettuata nei primi mesi di vita. Pertanto è necessaria la messa a punto di migliori diagnosi prenatali della malattia.
Inoltre in un'eventuale futura sperimentazione su uomo sarà necessario trovare una strategia per ottenere una espressione a lungo termine degli shRNA terapeutici. Potrà rivelarsi utile per esempio la costruzione di un vettore ibrido in grado di integrarsi nel genoma ospite.
1)fluorometric assay based on the conversion of 4-methylumbelliferone α-L-iduronide substrate into fluorescent product
2)DKCre Cell infettate con CAV-IDUA-GFP
Materials and costs 12 12