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M ass S pectrometer(MS) 분자가 MS 내로 들어가면 분자는 이온화됨과 동 시에 더 작은 이온들 (fragments) 로 쪼개진다. 쪼 개진 이온들은 그들의 질량 / 전하 (m/z) 비에 따라 선택적으로 분리되어 이온수에 비례해 signal 을 만든다.

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1 M ass S pectrometer(MS) 분자가 MS 내로 들어가면 분자는 이온화됨과 동 시에 더 작은 이온들 (fragments) 로 쪼개진다. 쪼 개진 이온들은 그들의 질량 / 전하 (m/z) 비에 따라 선택적으로 분리되어 이온수에 비례해 signal 을 만든다. 이온들의 질량 / 전하비는 이온들의 생성된 양 (Abundance) 의 함수로 표시되어 mass spectrum 이 그려지며, 이 mass spectrum 을 이용하여 미지 성분의 정성확인을 할 수 있다. 이온은 양이온과 음이온 모두 사용

2 MS Component

3 MS component Sample inlet 시료도입장치로 시료를 MS 내로 효율적으로 보내주는 역할을 한다 Ion source 시료분자를 이온화시키고 더 작은 이온으로 쪼갠다. 생성된 이온들을 MS analyzer 쪽으로 이동시킨다 Mass analyzer 이온들을 m/z ratio 에 따라 선택적으로 분리시킨다 Ion detector 이온 흐름을 그 양에 비례하게 전기적인 흐름으로 전환, 증폭시켜 signal 을 생성한다 Vacuum system MS 내 진공상태를 ~ Torr 로 만들어 주어 최적의 상태로 분석 이 진행될 수 있도록 한다 Data System MS 내 각 구성성분들의 조절이 가능하며 시료분석과 동시에 데이터해 석을 할 수 있는 곳이다

4 Sample introduction / ionization method: Ionization method Typical Analytes Sample Introduction Mass Range Method Highlights Electron Impact (EI) Relatively small volatile GC or liquid/solid probe to 1,000 Daltons Hard method versatile provides structure info Chemical Ionization (CI) Relatively small volatile GC or liquid/solid probe to 1,000 Daltons Soft method molecular ion peak [M+H] + Electrospray (ESI) Peptides Proteins nonvolatile Liquid Chromatography or syringe to 200,000 Daltons Soft method ions often multiply charged Fast Atom Bombardment (FAB) Carbohydrates Organometallics Peptides nonvolatile Sample mixed in viscous matrix to 6,000 Daltons Soft method but harder than ESI or MALDI Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI) Peptides Proteins Nucleotides Sample mixed in solid matrix to 500,000 Daltons Soft method very high mass

5 Ion source Gaseous sample introduction - EI(electron ionization) - CI(chemical Ionization) Liquid sample introduction - FAB(fast atom bombardment) - ESI(electrospray ionization)(soft ionization) Solid sample introduction - MALDI(soft ionization) (matrix-assisted laser desorption/ionization)

6 Ion Source - EI(electron ionization) 전자를 발생시키기 위한 filament 가 가열되고 (+) 극판에 전압이 걸리면 가속된 전자들이 흐 르고 그 속을 지나던 기체화된 sample 은 전자 와 충돌하여 에너지를 얻고 전자 하나를 잃어 분자이온 M + 가 된다 이 방법은 큰 에너지를 사용하기 때문에 복잡 한 spectrum 을 이루며 분자 이온을 얻기 힘들 다 M + e - ⇒ M + + 2e -

7 Ion Source – CI(chemical Ionization) 가열된 filament 에서 발생, 가속된 전자는 10 6 정도로 많은 reagent gas 와 충돌하여 이들을 이온화시키고 이 reagent gas ion 은 sample gas 와 충돌 이 sample gas 는 fragmentation 되기도 하고 때로는 reagent gas ion 과 complex 를 이루기도 한다. 매우 낮은 에너지로 충돌하기 때문에 EI 보다 수백배 이상 많은 수의 분자 이온을 만들어 내기 때문에 분자 량 확인에 많이 쓰인다. R(CH 4 ) + e - ⇒ R e - R + + M ⇒ M1 + + N1 M1 + ⇒ M2 + + N2

8 Ion Source: ESI Electrospray ionization(ESI) 용액 상태의 시료를 이온화 (LC-MS) 기존의 방법으로는 얻기 힘들었던 intact 상 태의 peptide 나 단백질을 이온화 한 개 이상의 전하를 띤 이온을 생성

9 Ion Source: ESI 시료용액이 고전압이 걸려 있는 capillary 를 통 과하면서 분무되어 전하를 많이 띤 droplet 이 생성됨 dropolet 이 capillary 에서 orifice 를 지나면서 inert gas(or heat) 에 의해 desolvation Desolvation 과정에서 ion 의 charge 는 더 증가 하고 “ Coulombic explosion ” 에 의해 droplet 의 ion 이 gas phase 로 된다. sample 에 가해지는 충격이 약하며, multiple charge 를 가진 peptide 이온이 생긴다.

10 Ion Source: ESI

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14 Ion Source: MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization(MALDI) Laser matrix + analyte Sample support a m m m m m m m m a a a a m a m +

15 M A L D I

16 Why MALDI? -Less sensitive to salts -Lower PRACTICAL detection limits -Easier to interpret spectra(less multiple charges) -Quick and easy -Higher mass detection -Higher Throughput(1000>samples per hour)

17 Matrix

18 Biomolecule Analysis 과거에는 ? Electrophoresis, chromatography, ultracentrifugation Not very precise MS 이용하면 ? Proteins, oligonucleotides, oligosaccharides, lipids Detect modifications and sequences

19 Biomolecule Analysis Mass is one of first measurements to characterize biopolymers Up to 1970s, had to use–Electrophoresis– Chromatography–Ultracentrifugation–Not very precise (10 –100% relative error!!) May use MS on most biomolecules– Proteins–Oligonucleotides– Oligosaccharides–Lipids May detect modifications and sequences– Post translational and other

20 Peptide Mass Fingerprinting Analytical technique for protein identification (protein sequence) Unknown protein of interest cleaved into peptide by protease Collection of peptides resulting from this cleavage comprise a unique identifier of the unknown protein Mass measured with MALDI-TOF and ESI-TOF in silico compared to the genome

21 Computer programs translate the known genome of the organism into proteins Theoretically cut the proteins into peptides with the same protease (ex.Trypsin: K or R) Calculate the absolute masses of the peptides from each protein the masses of the peptides of the unknown protein vs the theoretical peptide masses of each protein encoded in the genome Results statistically analyzed to find the best match

22 In Gel Digestion & Mass Spectrometry

23 Trypsin Digest Cut out 2D-Gel Spot ProteinPeptides

24 Peptide Mass Fingerprinting Trypsin NK K K K K K R R R R C N C K K K K K K R R R R Protein Tryptic peptide mixture. Masses measured by MS. Every peptide has a basic C- terminus. A protein can be identified in a database by matching masses of a subset of the tryptic peptides against calculated values.

25 MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT intact protein enzyme peptide fragments

26 Peptide Mass Fingerprinting 2D-Gel In Gel Digestion MS Database Is identical to In Silico Digestion “ Spot removal ”

27 Protein sequence Analysis

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29 Deduction of Full Amino Acid Sequence of a Protein by Overlapping the Sequences Obtained from individual Peptides

30 Edman Degradation Sequentially Removes One Residue at a Time from the Amino End of a Peptide up to 50 times Each round can be complete within 1 hr and the Edman degradation can be repeated up to 50 cycles in Practice.

31 Measured peptide mass 와 sequence 가 맞 지 않는 경우 The additional masses are due to posttranslational or artifactual modifications or post-translational processing Unspecific proteolysis had occurred or contaminating protease was present Protein was part of a mixture of ‘ contaminating ’ proteins

32 Post Translational Modifications(PTM’s) PTM’s are very important in signaling as well as metabolic pathways (e.g. phosphorylation) Often we want to know not only which modification a protein has undergone, but exactly where in the sequence the modification lies. Many of the search engines allow for “variable” modifications, but very few at one time (combinatorialy explosive) There is great opportunity here for robust searches that find PTM’s reliably!

33 Phosphorylation site analysis strategies Complication of phosphoprotein analysis - the frequently low stoichiometry of phosphorylation - the presence of multiple, differentially phosphorylated forms In vitro analysis - scale up of protein by kinase reaction - comparison with 2D-PP maps of in vivo (confirmation of identity indirectly) - MS analysis

34 Detection and isolation of phosphoproteins For the analysis of the site(s) of protein phosphorylation - purification of phosphoprotein - enzymatic or chemical fragmentation of the phosphoprotein - Isolation, separation, analysis of peptide Isolation - separation of proteins by gel electrophoresis - fragmentation of the phosphoprotein band or spot - extraction of the generated phosphopeptide More positive identification - 32 P radiolabelling : in vivo( 32 PO 4 ), in vitro([γ- 32 P]ATP) - western blotting : particularly tyrosine phosphorylated protein

35 Separation of phosphopeptides 필요한 이유 - 농도를 농축하는 역할을 하여 S/N 비를 높임 - radiolabel 의 activity 를 이용하여 phosphopeptide 의 상대적 또는 절대적인 양을 구할 수 있음 - separation 에 의해 확보된 재현성으로 단백질 의 phosphorylation 상태를 정량적으로 결정할 수 있음 - nonpeptide contaminants 를 제거하여 적은 양 의 phosphopeptide 의 분석을 용이하게 함

36 Phosphopeptide separation techniques By 2-dimensional phosphopeptide map Reversed-phase HPLC High-resolution gel electrophoresis Immobilized metal affinity chromatogrphy(IMAC) Phosphopeptide 는 상대적, 절대적으로 적은 양 때문에 분석이 어려우므로 이러한 점을 극복할 수 있는 최적의 separation 방법을 선택해야

37 Separation by 2D-PP 1 st dimension by electrophoresis on thin-layer cellulose plate + 2 nd dimension by TLC on the same plate information - radiolabelled spot 수 ⇒ phosphorylated sites 최대수 - radiolabelled spot 의 intensity ⇒ peptide 들의 상대적인 phosphorylation 정도 - relative state between phosphopeptide MS analysis after extraction from plate - protease 양이 중요 sensitive and reproducible by radiolabelling

38 Separation by RP-HPLC Reproducible and simple column 으로 분리하고 radioactivity count 로 fraction ⇒ count 를 시간의 함수로 하여 radioactive fraction 의 수를 알 수 있음 단점 - very hydrophilic phosphopeptide, very hydrophobic phosphopeptide 의 분리가 어렵다 - 2D-PP 보다 resolution 이 낮다 - phosphopeptide will stick to metal surface 장점 - ESI MS 와 on line 으로 연결하여 사용할 수 있다 (LC-MS/MS) - isotope 을 사용할 수 없는 인체 단백질 분석 가능

39 Separation by high-resolution electrophorsis and IMAC High-resolution gel electrophoresis - 2-DE - 특정 phosphopeptide 의 손실이 많지만 널리 보급되어 있 어 사용하기 좋음 IMAC - 같은 sequence 를 갖는 nonphosphorylated peptide 에 비 하여 상대적으로 매우 적은 양의 phosphorylated peptide 의 분석 어려움 - separation and enrichment 1) phosphopeptide 와 metal(Fe 3+,Ga 3+ ) 의 chelating 2) elution by phosphate or increased pH 3) acidic amino acid 도 enrichment 되는 단점

40 Determination of the type of phosphorylated amino acid 이유 가능한 phosphorylated site 의 수를 찾아냄으로써 polypeptide 내 의 phosphorylated residues 의 assignment 를 쉽게 할 수 있음 Technique 1) phosphoamino acid analysis - 32 P-amino acid(hydrolysate of 32 P-labeled phosphoprotein or phosphopeptide) ⇒ autoradiography - phosphoamino acid standard ⇒ ninhydrin staining - sample 과 standard 의 비교 분석 ( 보통 1site/phosphopeptide) 2) phospho-amino acid-specific immunodetection - antibodies specific for particular phospho-amino acid - 상업적으로 antibody 판매

41 Determination of the site of phosphorylation Chemical phosphopeptide sequencing - phosphopeptide sequencing by step-wise chemical degradation(nonradioactive, radioactive methods) - analyzed as phenylthiohydantoyl derivatives - not available in very limited amount Mass spectrometric analysis of phosphopeptides - phosphopeptide 의 양이 1pmole 이상이면 2D-PP map 에서 extraction 이 가능하고, MS 로 분석이 가능 - two basic theme 1) chemical lability of the phosphate ester bonds 2) the detection of the mass added to a peptide (80u) - product ion scan in a tandem MS 으로 phosphorylation site 확인 ⇒ phosphorylated amino acid type 을 알고 있으면 더 용이

42 Mass scan for phosphopeptides analysis In-source CID - identify phosphopeptides by observation of H 2 PO 4 - (97U), PO 3 - (79U) and PO 2 - (63U) - detect phosphopeptides in negative ion mode and then switch to positive ion mode Neutral loss scan - positive ion mode with ESI in a TQ MS - Q1, Q3 are scanned over different m/z ranges - neutral loss of phosphoserine and phosphothreonine : 98

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45 Mass scan for phosphopeptides analysis Presursor ion scan - negative ion ESI( 다시 positive ion mode 로 변경 ) - Q1 : continous scan, Q2 : ion fragmentation Q3 : 79m/z(PO 3 - ) 를 잃은 ion 만 통과 Product ion scanning - in-source CID, neutral loss and precursor ion scanning 는 특수한 경우에만 phosphorylated residue 를 identify - 상기 3 가지 방법을 이용할 수 없는 경우 peptide fragment ion 전체에 대한 해석이 필요

46 Mass scan for phosphopeptides analysis Post-source decay MALDI Enzymatic and chemical dephosphorylation - MALDI-TOF 로 phosphopeptide 의 mass 측정 + phosphate 를 제거 후 MALDI-TOF 로 mass 측정 - nonphosphorylated peptide 에서 phosphopeptide 를 확인하는데 쉽게 이용 - identification of phosphorylation sites using MS/MS

47 Emerging methods and future directions in phosphoprotien analysis in vivo 와 비교해서 in vitro 로 시험하나 동일하다는 보장 이 없음 ⇒ in vivo 를 직접 in vivo 32 P-labeled protein 을 충분히 얻는다는 것은 어 려우므로 분석기기 감도를 높이는 것이 유리

48 Present and future challeges and opportunities Protein identification and characterization has to be performed in a high-throughput manner, efficiently and with high accuracy and sensitivity Robotic system 2D-chromatography MS/MS

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