Presentation is loading. Please wait.

Presentation is loading. Please wait.

انواع بافت وتثبیت کننده های بافتی دکتر احیا پورجهانی.

Similar presentations


Presentation on theme: "انواع بافت وتثبیت کننده های بافتی دکتر احیا پورجهانی."— Presentation transcript:

1

2 انواع بافت وتثبیت کننده های بافتی دکتر احیا پورجهانی

3

4

5 Freeze for protein, lipid, sugar, DNA/RNA etc.extracts Isolate cells for culture Freeze for histology/histochemistry/ & use for immunohistochemistry Process for EM Process into paraffin blocks Processing of tissue : -Fix -Dehydrate -Infiltrate with xylene -Infiltrate with hot paraffin wax -Make blocks for sections -Store at room temperature Dry ice in 2-methyl butane Frozen or paraffin tissue can then be sectioned for histology micron sections

6

7

8

9  Not slicing the tumor specimen  Immediately placing the specimen into fixative

10  Types : Reusable or Disposable  Clean & uncontaminated  Adequate size  Labeled after placing the specimen

11 روی ظرف : نام و نام خانوادگی بیمار نام پدر سن بیمار توسط پرسنل مسئول اتاق عمل نام پزشک جراح تاریخ عمل جراحی نوع نمونه شماره نمونه توسط مسئول پذیرش واحد پاتولوژی تاریخ تحویل نمونه

12

13  1)consistency  Solid/hollow/firm/hard/soft/gelatinous/…  2)volume  Huge/Large/small/tiny/…  3)type of organ  Stomack/breast/uterus/…

14 Neural Respiratory: Brain : Cerebrum, Lungs and trachea Olfactory, Cerebellum Other: Spinal cord and peripheral nerves Eyes, Inner ear, nasal passages Vascular: Hematologic: Heart and blood vessels Spleen, Thymus, Bone Marrow Lymph nodes and Peyer’s patches Integument: GastroIntestinal: Skin, Bone, Cartilage Liver, Salivary Gland, Pancreas Skeletal muscle,Stomach and Duodenum, Stroma and Adipose tissue Small intestine (Ileum) Large intestine (Colon), Cecum GenitoUrinary Endocrine: Kidney, Bladder Adrenals, Pituitary Uterus, Ovary, Fallopian tubes Thyroid, Parathyroid Testis, Prostate, Breast, Placenta

15  1) Dissociation salty solution phase contrast microscope  2)Smear  3) thick section prep ultrapak  4) sectional method  5) frozen section

16

17 goal Adequate fixation

18

19

20

21

22 1) Prevent postmortem changes ( autolysis/putrefaction/bacterial attack) 2)Preserve cell consititutents 3)Protect by hardening the naturally soft tissue 4)Convert the normal semi-fluid consistency of cells to an irreversible semi-solid consistency 5)Aid in the visual differentiation of structure by application of biological dyes &chemicals 6) To give tissue a texture which permits easy sectioning

23  Fresh tissue  Proper penetration of fixative  Right choice of a correctly formulated fixative

24

25

26

27

28

29

30

31 با ایجاد امواج ماکروویو سبب فعل و انفعالات در بین مولکولهای دوقطبی شده و با تولید نوساناتی به شدت 2450 مگاهتز باعث ایجاد حرارت در مولکولهای آب و بخش قطبی زنجیره های پروتیینی میگردد. درجه حرارت اپتیمم برای ایجاد فیکساسیون درجه میباشد. حرارت کمتر باعث اشکال در برش بافتی می گردد. حرارت بیشتر سبب ایجاد واکوئل و بیش از حد رنگ گیری سیتوپلاسم ونیز اثرات پیکنوتیک هسته می شود. این تکنیک برای مطالعات روتین میکروسکوپی وایمونوهیستو شیمی مناسب است.

32 Aldehydes:formaldehyde,glutaraldehyde,acrolein, glyoxal Oxidizing agents: osmium tetroxide, potassium permangenate,potassium dichromate Protein-denaturing agents or coagulant: acetic acid, methyl alcohol (methanol), ethyl alcohol (ethanol). Other cross-linking agents:Carbodiimides Physical : Heat, microwaves Miscellaneous :mercuric chloride, picric acid, non-aldehyde- containing fixative,dye stuffs

33  1. Aldehydes, such as formaldehyde, glutaraldehyde  2. Oxidizing agents: metallic ions and complexes, such as osmium tetroxide, chromic acid.  3. Protein-denaturing agents, such as acetic acid, methyl alcohol (methanol), ethyl alcohol (ethanol).  4. Unknown mechanism, such as mercuric chloride, picric acid.  5. Combined reagents.  6. Microwaves.  7. Miscellaneous: excluded volume fixation, vapour fixation

34  Aldehydes formaldehyde & glutaraldehyde Tissue is fixed by cross-linkages formed in the proteins, Glutaraldehyde causes deformation of alpha-helix structure in proteins so is not good for immunoperoxidase staining  Mercurials mercuric chloride & B-5 and Zenker's unknown mechanism  Alcohols methyl alcohol & ethyl alcohol protein denaturants and are not used routinely for tissues  Oxidizing agents potassium permanganate & potassium dichromate & osmium tetroxid cross-link proteins  Picrates picric acid unknown mechanism

35 Group I: Prefixation parameters Group II: Intrafixation parameters Group III: Post-fixation parameters

36 1. Constant factors a. Nature of the anesthetic b. Duration of anesthesia c. Anoxic injury in situ 2. Variable factors Prefixation time

37 1. Properties of the fixatives a. Chemistry and mechanism of action b. Tissue penetration 2. Condition of fixation a. Temperature b. Duration c. pH d. Osmolarity e. Concentration f. Size of the specimen g. Volume of the fixative

38 1. Storage parameters a. Duration b. Temperature c. Condition (vacuum/nonvacuum packed) 2. Nature of the biological factor to be analyzed a. Proteins b. Enzymes c. Lipids d. Nucleic acids e. Mucopolysaccharides f. Biogenic amines g. Glycogen

39  Satisfactory fixation PH:6 and 8  Spesific purposes : Gastric mucosa :5.5 Catecolamines :6.5

40  Fixation of surgical specimen : room tempreture  Electrone microscopy : 0-4 c  Heated formalin :60c for rapid fixation of very urgent biopsy specimen

41 1) Thickness of slices Should not be more than 5 mm & 1mm 3 for EM 2) Adequate volume of fixative > 2/3 of the container volume 10 times volume of fixative to tissue 3)Type of specimen Open out or fill with hollow organs by fixative Inject fixative in large specimens

42  D=K  T  D: depth of penetration  T: time  K : coefficient of diffusibility  Distance (mm) that the fixative has diffused into the tissue on 1 hour

43 fixativeFixative concentratio n(%) K(Tissue)K(gel) Acetic acid Chromium trioxide formaldehyde ethanol1001- glutaraldehyde Mercuric chloride methanole Osmium tetroxide Picric acidsatd Potassium dichromate

44  The best osmolality : mOsm  Hypertonic cell shrinkage  Isotonic swollen cell(340 mOsm )  Hypotonic poor fixation

45 1)Formalin/formol/formaldehyde solution 2) Alcohol – Acetone 3) Bouin ΄ s solution 4) B – 5 5)Glacial acetic acid 6)Ethyl alcohol % 7)Mercuric chloride 8)Picric acid 9)Chromic acid 10) zenker ΄ s solution 11) Carnoy ΄ s solution

46 Commercially available solutions : % formaldehyde in water Conventional fixation Is usually carried out in 10% neutral buffered formalin ( NBF )

47 روش مرجع استفاده از فرمالین 10% بافر شده با زمان مناسب جهت فیکاسیون بافتی روش استاندارد تهیه محلول 10% از فرمالین تجارتی (37%) ، دارای وزن مخصوص نهایی 1/012 الی 1/020

48  فرمالین 40% 100 میلی لیتر  سدیم فسفات منوبازیک منوهیدرات 4 گرم  سدیم فسفات دی بازیک آنهیدروز 5/6 گرم  آب مقطر تا 1 لیتر

49 زمان فیکساسیون معمولاً بیشتر از 8 ساعت و حداکثر بین ساعت است برای کوتاه کردن زمان فیکساسیون می توان نمونه ها رادر یک ظرف بزرگ محتوی فیکساتیو در 60 درجه سانتی گراد غوطه ور ساخت آن کنترل گردد ( خنثی با کمی اسیدی )PH باید هر هفته جایگزین شده و

50 واکنش آن با پروتئین های نسجی متعدد وترکیبی است که باعث رسوب پروتئین ها نمی شود باعث حفظ یا تخریب نسج چربی نمی شود برروی کربوهیدراتها اثرفیکساتیوی ندارد باعث فیکس شدن پروتئین هایی که گلیکوژن را احاطه نموده اند می گردد دارای اثر بطئی است ،بنابراین درزمان کوتاه، فیکساسیون کامل نمی شود برای نگهداری طولانی مدت نسوج جهت انجام آزمایشات ایمونوهیستوشیمی مناسب نیست دارای خاصیت تداخل با آنتی ژن ها است و باعث نا پدید شدن نسبی آنتی ژن ها می شود فرمالین و اسید کلریدریک نباید باهم ترکیب گردند دارای اثرات سوء بر دستگاه تنفس داشته و کارسینوژن می باشد

51  Readily available  Penetrates tissue quickly  Long term storage in formalin is possible

52  penetrates quickly but fixation is slow ( may not be complete with shorter times )  May not be suited to long term storage of tissue for IHC  Hardens specimens  Antigen cross-linking  Partial Ag disappearance  Special handling & disposal requirements

53 1) Zinc formalin Mixture of zinc sulfate and formalin Fixation time : 4 – 48 hrs ( hrs for complete fixation )  Benefits Shorter fixation time Minimal need for Ag unmasking or retrieval Preserve better tissue Ag morphology  Disadvantages Possible quenching of primary fluorescence Special handling and disposal requirements

54 2) formalin saline Formalin 40% ml Aqua solution NACL ml Benefits For pathologic musium General cytology Disadvantages Slow fixation Shrinking Pigmentation

55  Alcoholic formaldehyde : 40% formaldehyde 100ml 95%Alcoholic 900ml Calcium acetate 0.5g  Formol calcium 40% formaldehyde 100ml Distilled water 900ml 10%Calcium chloride 100ml

56  Alcohol – Acetone  Carnoy, s fixative  Ethyl alcohol %

57  90 % Ethanol + 10 % acetone  Used for Histopathology Cryostat frozen section Cytology smears  Fixation time Variable often in tissue processing secondary to formalin fixation Time : minutes cryostat sections cytology smears

58  Benefits Shorter fixation time ( 5 mm 3 in 4 hrs ) Better cryostat sections Good preservation of cytoplasmic intermediate filaments  Disadvantages Decreased quality and integrity of IHC staining ( especially after long term storage ) Ethanol has shrinking & hardening effects on tissues

59 اسید استیک گلاسیال (10 سی سی )+ کلروفرم (30 سی سی )+ الکل مطلق ( سی سی 60) یکی از بهترین نفوذ کننده ها و سریعترین آنها است. برای نسوج با اندازه نرمال مدت 3 ساعت فیکساسیون کافی است. هیچگونه شستشویی لازم نیست و نسوج بلافاصله به الکل مطلق قابل انتقال هستند. باعث فیکساسیون عالی هسته ای و حفظ مواد نیسل ، پلاسما سل ها و گلیکوژن می شود. بسیاری از چربی ها را حل می کند. برای یافتن عقده های لنفاوی در نمونه های عمل جراحی رادیکال بسیار مناسب است.

60  Preservation of glycogen  E-OH Acetaldehyde Acetic acid  Can not combined with chromic acid  Slow penetration  shrinking & hardening effects  Makes nuclear staining difficult

61 به صورت محلول آبی اشباع شده ( یک درصد ) مصرف می شود. دارای نفوذ کم بوده و باعث چروکیدگی بافتها می گردد ولی آنها را سخت نمی کند. در ترکیب با پروتئین ها باعث رسوب آنها می شود و تقریباً تمام عناصر دیگر را حفظ می کند. اسید پیکریک به تنهایی مصرف نمی شود.

62  Buin, s fluid  Gendre, s fluid  Rossman, s fluid

63  Mixture of formalin and picric acid  Used for : connective tissue  Fixation time : hrs  Benefits : To demonstrate chromatin ( if using iron haematoxylin methods ) Useful particularly for endocrine tissues and tumors Useful for cytological fixation & small biopsy

64  Disadvantages Preservation of many types of Ag s ( particularly lipid containing Ag s ) Poor penetration Longer fixation brittle tissue nuclear staining

65 Saturated aqueous picric acid 75 ml 40% formaldehyde 25 ml Glacial acetic acid 5ml  Fixation may vary from a few hours to 18 hours

66 90% ethanol saturated with picric acid 80 ml 40% formaldehyde 15 ml Glacial acetic acid 5ml  Fixation is normally for 4 hours,followed by washing in 80%,95% and 100% ethanol

67 100% ethanol saturated with picric acid 90 ml Neutralized commercial formalin 10 ml  Fix for hours and wash several days in 95% ethanol

68 محلول های آبی اشباع شده (7%) یا نیم اشباع مصرف می شود. میزان نفوذ آن خیلی سریع است. پروتئین ها را رسوب می دهد. ایجاد تورم می کند بنابراین در هنگام قالب گیری ایجاد چروک مختصر می کند. کروماتین را به خوبی ثابت می کند. مواد فلزی را خراب میکند. این ماده به ندرت به تنهایی به کارمی رود.

69  Buffered formaldehyde sublimate  Zenker, s fluid (after lillie)  Helly, s fluid  Susa fuid  B-5

70 Mercuric acid 6g Distilled water 90 ml Sodium acetate 1.25 g 40% formaldehyde 10 ml  the formaldehyde is added last

71 بی کرومات پتاسیم + بی کلرور جیوه + سولفات دوسود به خاطر اثر جمع کنندگی و چروکیدگی آن به ندرت استفاده می شود. در موارد تماس طولانی باعث سفت شدگی نسج می گردد. اندازه نسج نباید بیشتر از 5 میلی متر ضخامت داشته باشد. بدون آنکه باعث خراب شدن لیپیدها شود به سرعت در آن ها نفوذ می کند. گران بوده و احتیاج به دور ریختن دقیق جیوه دارد. اغلب برای بیوپسی کلیه ،مغزاستخوان و عقده لنفاوی و بیضه کاربرد دارد.

72 Distilled water 950 ml Potassium dichromate 25 g Mercuric chloride 50 g Glacial acetic acid 50 g

73 Distilled water 1000 ml Potassium dichromate 25 g Sodium sulfate 10 g Mercuric chloride 50 g

74 Distilled water 80 ml 40% formaldehyde 20 ml Mercuric chloride 4.5 g sodium chloride 0.5 g Trichloroacetic acid 2 g Glacial acetic acid 4 ml

75  Formalin + mercuric chloride + sodium acetate  Fixation time : 1 – 6 hrs  Benefits : Primary use in lymph node tissue Enhanced cytological detail and immunoreactive of cytolological Ig s & intracytoplasmic Ag s  Disadvantages : Tissue hardening Surface Ags not well demonstrated Special handling & disposal requirements

76 این ماده باعث تورم ساختمان سلولی می شود بنابراین به تنهایی کاربرد ندارد. میزان نفوذ آن سریع و خوب است. استفاده از اسید استیک باعث حفظ هسته ها می شود. اسید استیک باعث رسوب نوکلئو پروتئین ها می شود. اسید استیک باعث تخریب میتوکندری و دستگاه گلژی می گردد. باعث فیکس شدن لیپیدها و کربوهیدراتها نمی شود. باعث نرم ماندن نسوج شده واز سفت شدگی آن ها بدنبال استفاده ثانوی از الکل جلوگیری می کند. برای مطالعات کروموزومی مناسب است.

77 به صورت خالص یا مخلوط با بی کرومات و اسید استیک ( محلول زنکر ) مصرف می شود. با رسوب پروتئین و یا دناتوره کردن آن ها بافتها را فیکس می کند. از آنجا که نوکلئوپروتئین ها را حل می کند هسته رنگ نمی گیرد وباعث ایجاد مختصری شکنج بافتی می شود.

78  The fixative is suitable for use with sections of frozen tissue, cytology preparations (including touch preparations and blood smears) and other specimens used for immunohistochemical analysis.  concentration of from about 0.01 to about 0.25M, preferably, 0.02 to 0.25M, in an acidic buffer having a pH of from about 2 to about 6.

79  Karnovokys solution: paraformaldhyde- glutaraldehyde (1965) :preserve morphology& chemical activity  Acrolein: (saito & keino 1976) glutaraldehyde/formaldhyde : preserve morphology & enzyme activity

80 تتروکسید اسمیوم یا اسید اسمیک سیتولوژیک و تجسس چربی محلول فرمول کلسیم فسفولیپیدها محلول فرمول جیوه برای تمام رنگ آمیزی ها از جمله نقره ای محلول الکلی نیترات سرب – فرمالین لیلی بافتهای همبندی مزانشیمی و موکوسی و جسم ویتره حفظ مناسب المان های سیتوپلاسمی CLARKE ΄ S محلول مطالعات کروموزومی NEW COMER ΄ S محلول گلوتارآلدئید درمطالعات با میکروسکوپ الکترونی محلول بوئن هولاند اجسام آهکی استخوان و نکروزچربی محلول جندر فیکساتیو هیستوشیمی محلول فرمالین سرد در استون فیکساتیو هیستوشیمی

81 رنگ آمیزی ممکن انکلوزیون مدت پا یداری ضخامت موارد استعما لنوع پایدار کننده تمام انواع 1-8 روز (3 روز )10mm سیتولوژی عمومی،دکلسیفیکاسیون، بافت نرم بوئن تمام انواعتمام انواع انکلوزیون ها 30 دقیقه تا 3-1 روز 5-1mm برای بند پایان، بیوپسی دوبسک برازیل تمام انواعتمام انواع انکلوزیون ها 1-8 روز (3 روز )10mm سیتولوژی هسته و میتوکندری بوئن تری کلرواستیک تمام انواعتمام انواع انکلوزیون ها ساعت 5mm اعضا هماتوپویتیک زنکر ترجیحا رومانوفسکی تمام انواع انکلوزیون ها 7-8 ساعت 3mm اعضا هماتوپویتیک سیتولوژی میتوکندری هلی ( زنکرفرمل ) تمام انواع تمام انواع انکلوزیون ها 48 ساعت 10mm سیتولوژی عمومی فرمل نمکی تمام انواع سلوئیدین 30 دقیقه 1mm گلیکوژن، انکلوزیون عصبی کارنوی رنگآمیزی مان کارمن تمام انواع انکلوزیون ها 24 ساعت 5mm گلیکوژن، انکلوزیون عصبی ،اسپیروکت الکل فرمل هماتوکسیلین ، سودان 3 تمام انواع انکلوزیون ها چندین روز 5mm سیتولوژی ، میتوکندری ، چربیها رکو ( بیکربنات فرمل )

82  Urgent paraffin section alcohol-containing fixative Such as : Clark, s fuid / carnoy, s fixative /formol alcohol Clark, s fuid absolute alcohol 75 ml + Glacial acetic acid 25 ml

83  Tissue disruption and removal of minerals, particularly hemosiderin  The procedure : - Adequately fixed tissue ( 48 hrs ) - Draining off fixative - Replacing decalcifier ( 10 X to 20 X specimen volume ) - Everyday checking for presence of Ca ++ ( with dipstick or ammonium oxalate )

84  HCL concentrated 80 ml  Formic acid 90% 100 ml  Distilled water 1000 ml

85 روشها : 1) فریزینگ سریع در نیتروژن مایع 2) روی یخ خشک در ایزوپنتان سرد 3) در استون سرد 4) در کرایو استات CO2 jet 5)

86  Frozen sections should not be cut on unfixed tissue unless there is a pressing need for public health reasons.  Fixation of cryostat frozen sections for five to ten minutes in ambient or cold acetone or a 90% EtOH to 10% acetone mixture can provide suitable fixation.

87  Solid tissue from postmortem or surgical specimen  Ideally tissue should be snap-frozen or fixed immediately  If freezing is not possible, refrigeration may be adequate  Alcohol- based fixative  Fixed paraffin - embedded tissue

88 Serial number FixativeTemperature of fixative Duration of fixative Temperature of paraffin block Duration of storage Tissue 110% NBF4 C 1 hourNA Rat liver 210% NBFRT 2,7,24 hoursRT1–4 weeksMouse spleen 310% NBFNA 24 hoursRT in a light resistant closed box 1,4,9,14,20,27, 35 days Rat skin wounds, myocardial infarcts 410% NBF Human 510% NBFRT? 18 hoursNA Human skin and lung 610% NBFRT? 6,24,48,72 hours, 1 week NA Human breast (adenoma/cyst) 710% NBFRT? NA Human lymphoid, parotid, gut, liver, and kidney 8 Ethanol (100%) RT6,24,48,72 hours, 1 wk NA Human breast adenoma 9 Methanol (100%) RT12 hoursNA Human cancerous tissues

89 Serial number FixativeTemperature of fixative Duration of fixative Temperature of paraffin block Duration of storage Tissue 10 Alcoholic formalin RT5 yearsHuman skin 11 Omnifix6,24,48,72 hours, 1 wk Human breast adenoma 12 Carnoy’s fixative NA2,8,48 hoursRT1–4 weeksMouse spleen 13 Carnoy’s fixative RTOvernightRT2 years (maximum) Mouse liver 14 Methacorn4 C1 hourRat liver lung, and kidney 15 Acetone4 C18 hoursNA Human skin, lung 16 Bouin’s4 C18 hoursNA Human skin, lung 17 AMeX-20 COvernightNA Mouse liver and human lymphoma 18 HOPE0–4 COvernightNA1–5 yearsMouse liver 19 PBSMicrowave for 10–20 NA Human liver

90 1)10% neutral buffered formalin ( NBF ) 2) Gendre modified fluid ( picric acid+ formalin+Glacial acetic acid) 3)Zinc formalin 4) Alcohol/Acetone 5)Bouin ΄ s solution 6) B – 5

91  For IHC the fixative can be formalin or Bouin’s solution  For FISH the fixative must be formalin  Optimal fixation time is between 24 and 48 hours

92 1)Alcohol 2) Parafolmaldehyde 3) Ultrapure formaldehyde

93

94 A. EM (1.5) B. Similarities with LM 1. electron source (vacuum) [light] 2. condenser (electromagnetic) lens 3. specimen chamber [stage] 4. objective lens 5. projector lens 6. fluorescent screen 7. camera

95  Good" preservation of cellular 3-D structure and "Adequate" access to antigenic sites. use of a fixative that does not destroy in vivo structure and organization must be found. Glutaraldehyde (GA) is a commonly used fixative for electron microscopy  paraformaldehyde (PFA)  different specimens may require a different fixation method

96  Immunofluorescence acetone  Electron microscopy Nitrogen mustard N-oxide was tried for the fixation of tissue for electron microscopy. A fixative consisting of 1% nitrogen mustard N- oxide, 1% glutaraldehyde and 1% paraformaldehyde buffered at pH 7.4 followed by 1% OsO4 buffered at pH 7.4

97 If a dissecting microscope is available submitted biopsy in two vials One piece (the larger) in 10% buffered fomalin one piece in Zeus (Michel’s) fixative If no dissecting microscope is available the larger biopsy piece in formalin for light &electron microscopy (EM) the smaller piece in Zeus (Michel’s) fixative for immunofluorescence (IF). We will further divide the formalin-fixed piece for electron and light microscopy. 10%buffered formalin provides acceptable fixation for routine diagnostic electron microscopy on renal biopsies. If 3% glutaraldehyde is available and you have a dissecting microscope, Put the largest piece in formalin, The second in Zeus (Michel’s) fixative for IF The third in 3% buffered glutaraldehyde for EM.

98  Formalin pigment : is produced under acid condition  Fluorescence in tissue : may induce by aldehydes  Crust effect : intense eosinophilia at the center of tissue in H&E stained sections due to protein coagulation by ethanol of partially fixed protein

99 H. Staining 1. inadequate rehydration (uneven staining) 2. too dark or too light (timing off) 3. inadequate agitation

100 I. Coverslipping Bubbles

101 I. Coverslipping 2. excess Per mount 3. two cover slips

102 G. Mounting sections 1. folds & tears 2. excess albumin (stain)

103 F. Poor sectioning 1. knife marks (scratches perpendicular to knife edge) 2. compression (waves parallel to knife edge)

104


Download ppt "انواع بافت وتثبیت کننده های بافتی دکتر احیا پورجهانی."

Similar presentations


Ads by Google