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Gene therapy for Dyskeratosis Congenita (DC)

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Presentation on theme: "Gene therapy for Dyskeratosis Congenita (DC)"— Presentation transcript:

1 Gene therapy for Dyskeratosis Congenita (DC)
Davide De Rocco Lorenzo Errichelli Marco Fabiani Valentina Flamini A.A

2 Physical abnormalities
Rare disease (prevalence: 1/ ) La Dyskeratosis Congenita (DC) è una patologia rara (prevalenza 1:1milione) che può colpire diverse parti del corpo. Le caratteristiche principali legate alla patologia sono tre: crescita anormale delle unghie, macchie cutanee soprattutto sul collo e sul petto, leucoplachia; quest'ultima consiste in una macchia bianca che si forma soprattutto nella cavità orale, a causa di una eccessiva ed anomala cheranitizzazione dell'epitelio. Le persone affette da DC sono particolarmente predisposte a sviluppare problemi a livello del midollo osseo (BMF: Bone Marrow Failure), una condizione che comporta una insufficiente produzione delle cellule del sangue. Poiché la funzione principale del midollo osseo è l'ematopoiesi, i malati possono sviluppare una forma di anemia (anemia apoplastica) che si verifica quando il midollo osseo non produce in quantità sufficiente nuove cellule del sangue; tali cellule, inoltre, possono non maturare in maniera corretta, condizione che porta allo sviluppo di leucemie. Oltre alla leucemia, pazienti affetti da DC presentano un rischio maggiore per l’insorgenza di altri tipi di cancro, in particolare al cervello, al collo o ano-genitale. Altre patologie legate alla DC sono: fibrosi polmonare, condizione che provoca una riduzione del trasporto dell’ossigeno nel sangue; anomalie dell’occhio, in particolare infezioni dei dotti lacrimali; anomalie dentali; perdita di capelli e comparsa prematura di capelli bianchi; osteoporosi; bassa statura; stenosi dell’uretra e infezioni del tratto urinario. Tuttavia la sintomatologia e la gravità della malattia variano molto da individuo a individuo e sebbene la maggior parte delle persone affette da DC presenti uno sviluppo psico-locomotorio normale, in alcuni casi la malattia può assumere diverse forme, anche gravi, come la sindrome di Hoyeraal Hreidarsson, caratterizzata da un sottosviluppo del cervelletto e che comporta, negli individui affetti, difficoltà nella coordinazione dei movimenti. Individuals with mutations in one of the known DC genes have variable clinical phenotypes Nature, Human genetics: Testing telomerase

3 Genes involved in DC Mutations in one of the six genes have been identified in approximately half of individuals who meet clinical diagnostic criteria for DC: DKC1,TERC, TERT, TINF2, NHP2, NOP10. The DKC1 gene provides instructions for making a protein called dyskerin, which is involved in manteinig the structures of telomers L’accorciamento dei telomeri è causato da una o più mutazioni in uno dei geni che compongono i complessi telomerasi e shelterin: DKC1, TERC, TERT, TRF2, NHP2 e NOP10. I telomeri sono localizzati alle estremità dei cromosomi e sono costituiti da corte ripetizioni nucleotidiche (TTAGGG)n e complessi proteici ad essi associati; le loro funzioni sono mantenere la stabilità, la giusta lunghezza e l’integrità cromosomica durante il ciclo cellulare. Generalmente diventano progressivamente più corti dopo ogni divisione cellulare; questo fino ad una lunghezza limite oltre la quale la cellula va incontro ad un processo di apoptosi. Complesso Telomerasi: mantiene la giusta lunghezza telomerica aggiungendo corte ripetizioni di DNA. Le due principali componenti della telomerasi sono: hTR (prodotto del gene TERC): RNA che funziona da templato per la telomerasi; hTERT (prodotto del gene TERT), proteina che aiuta l’aggiunta delle ripetizioni. Il prodotto del gene DKC1 (dyskerin) lega hTR stabilizzando il complesso della telomerasi. La telomerasi è espressa nelle cellule della linea germinale e nelle cellule staminali; generalmente non è attiva nelle cellule somatiche (oltrepassato il Limite di Hayflick) ma è stato osservato che in diversi tumori può essere attivata. Complesso Shelterin: aiuta a proteggere i telomeri dai processi di riparo del DNA; senza il complesso, il meccanismo di riparo potrebbe riconoscere le estremità cromosomiche come rotture nella sequenza del DNA e portare all’attivazione di esonucleasi con perdita di sequenza, apoptosi o sensescenza cellulare precoce. Riportiamo di seguito i geni coinvolti nello sviluppo della patologia: 1) DKC1 (Dyskeratosis Congenital 1): codifica per la proteina dyskerina; localizzazione citogenetica: Xq28; numero esoni: 15; 15.734bp (cDNA 1545nt); varianti patologiche: circa 40, la maggior parte delle quali comprende mutazioni puntiformi; funzione: la dyskerina è coinvolta nel mantenimento della struttura del telomero, in particolare lega hTR; una o più mutazioni nel gene DKC1 interferiscono con la capacità della proteina di legare hTR. 2) TERC (TElomerase RNA Component): codifica per un lncRNA (hTR); localizzazione citogenetica: 3q26; numero esoni:1; 451bp; varianti patologiche: 11 mutazioni (mutazioni puntiformi e poche delezioni); funzione: hTR, costituisce il templato di RNA che ibridizza con la sequenza complementare presente all’estremità 3’ del DNA telomerico, che viene così allungata dall’enzima telomerasi. Mutazioni nel gene TERC possono limitare in modo grave la capacità della telomerasi di allungare le estremità cromosomiche. 3) TERT (TElomerase Reverse Transcriptase): codifica per la proteina hTERT; localizzazione citogenetica: 5p15.33; numero esoni: 16; 4018bp (2992nt); varianti patologiche: 10 mutazioni, soprattutto puntiformi; funzione: hTERT è coinvolta nella stabilità del complesso della telomerasi in particolare si associa con hTR per l’aggiunta di ripetizioni. 4) TRF2 (TRF1 Interacting Nuclear Factor 2): codifica per TRF2; localizzazione citogenetica: 14q12; numero esoni: 9; 1869bp; varianti patologiche: 15 mutazioni tutte localizzate nell’esone 6; funzione: la proteina TINF2 fa parte del complesso shelterin; mutazioni a carico del gene che la codifica influenzano negativamente la stabilità del complesso. 5) NHP2 o NOLA2 (NHP2 Ribonucleoprotein Homolog Yeast): codifica per NHP2; localizzazione citogenetica: 5q35.3; numero esoni: 4; 867bp; varianti patologiche: mutazioni puntiformi tutte nell’esone 4. Il gene NHP2 è un membro della famiglia genica H\ACAsnoRNPs. Gli snoRNPs sono coinvolti nel processamento dell’rRNA e le varianti possono essere classificate in due famiglie: C\D e H\ACA; questi ultimi includono le proteine DKC1, NOLA1 e NOLA3, localizzate nei nucleoli e nei corpi di kajal, sono i componenti del complesso della telomerasi. Mutazioni in NHP2 riducono i livelli di TERC. 6) NOP10 o NOLA3 (NOP10 Ribonucleoprotein Homolog Yeast): codifica per NOP10; localizzazione citogenetica: 15q14-q15; numero esoni: 2; 552bp; varianti patologiche: mutazioni puntiformi. Il gene NOP10, come NHP2, è membro della famigliaH\ACA. The essential telomerase components. Mutations in telomerase and telomere components lead to syndromes of telomere shortening.

4 Testing Un individuo viene riconosciuto affetto da Dyskeratosis Congenita quando presenta almeno due dei tre fenotipi caratteristici della patologia: crescita anormale delle unghie, macchie cutanee soprattutto sul collo e sul petto, leucoplachia. Si procede quindi all'analisi della lunghezza dei telomeri, che negli individui affetti risultano più corti del normale, in relazione alla loro età. La diagnosi di tale patologia viene effettuata attraverso Flow-FISH (Multicolor-Flow-Cytometry Fluorescence in situ hybridization) su un substrato di cellule del sangue. In particolare tale esame viene effettuato su leucociti prelevati da pazienti con DC e loro familiari. La Flow-FISH è una tecnica che differisce dalla Q-FISH (descritta nelle note in diapositiva 8) in quanto, anziché cellule in metafase, analizza cellule in interfase e l’ibridazione tra PNA e target viene effettuata in sospensione. Nella figura abbiamo riportato un esame di Flow-FISH eseguito su pazienti affetti da DC e loro familiari: è evidente come, in tutte le cellule dei globuli bianchi (granulociti, linfociti, cellule T native CD45RA-positive/ CD20-negative, cellule T della memoria CD45RA-negative, cellule B CD20-positive e leucociti totali) dei pazienti affetti da DC e le sue varianti, la lunghezza dei telomeri sia minore che nei soggetti sani (abbiamo evidenziato con un cerchio rosso le posizioni sull'asse cartesiano dei soggetti malati). Sull’asse delle ordinate è rappresentata la lunghezza dei telomeri in kilobasi, su quello delle ascisse è indicata l’età degli individui. Il campione è costituito da 17 pazienti con DC (cerchi rossi), 4 con la variante Hoyeraal-Hreidarsson (triangoli verdi), 4 con la variante di Revesz (rombi azzurri), un portatore sano (quadrato blu) e 54 parenti sani (quadrati bianchi). Telomere length according to age in patients with dyskeratosis congenita and their relatives

5 Therapy In DKC1 mutations are more frequent than in the other genes (11-36%). Bone marrow failure (BMF) is the most important aspect of this disease. Objectives: To obtain a functional Telomerase complex To estabilish normal lenght of telomeres Per il nostro progetto abbiamo deciso di considerare le mutazioni a carico del gene DKC1 per i seguenti motivi: la maggior parte delle mutazioni a suo carico sono mutazioni puntiformi che ne alterano la funzionalità all’interno del complesso della telomerasi. Essendo un gene X-linked recessivo si presta maggiormente all’approccio terapeutico da noi pensato: l’inserimento di una copia wt nel genoma, integrata stabilmente, potrebbe essere sufficiente per il recupero della sua funzionalità; è il gene che nei pazienti affetti da DC si trova più frequentemente mutato (17-36%); la lunghezza del suo cDNA è compatibile con un approccio mediante lentivirus, molto indicati per agire sulle cellule del midollo osseo, che intendiamo utilizzare. Nonostante, nel complesso della telomerasi, DKC1 abbia una funzione esclusivamente di stabilizzazione, mutazioni in questo gene possono causare perdita di funzionalità della telomerasi anche in presenza degli altri componenti funzionali fra cui i ben caratterizzati TERC e TERT. Uno degli effetti più gravi della malattia è un'insufficienza del midollo osseo nella produzione di cellule del sangue (Bone Marrow failure, BMF) e tale aspetto è anche il principale motivo di morte (60-70%); per questo abbiamo deciso di applicare la nostra terapia alle cellule del midollo osseo. Abbiamo scelto il lentivettore perché presenta numerosi vantaggi per l'approccio terapeutico di nostro interesse: si integra stabilmente nel genoma; ha un’alta efficienza di trasduzione; ha un preferenziale tropismo per la linea mieloide (linfociti e macrofagi); la sua capacità di trasdurre cellule non in divisione permette anche la trasduzione di cellule staminali ematopoietiche, che saranno il bersaglio della nostra terapia. Inoltre il lentivettore è facilmente recuperabile dal supernatante dopo produzione in cellule 293T; in tal modo viene rispettato il ciclo biologico della cellula: la particella pseudovirale viene secreta, mentre ad esempio l’adenovettore non viene secreto e il modo per isolarlo è la lisi del le cellule. La nostra terapia prevede l’espianto di cellule del midollo osseo da pazienti con mutazioni nel gene DKC1, la creazione di colture dei precursori CD34+ (progenitori della linea mieloide) da trasdurre con il nostro costrutto lentivirale e la successiva valutazione dell’efficacia della terapia. Il nostro obiettivo è quello di ristabilire la funzionalità della telomerasi e verificarla attraverso la valutazione della lunghezza dei telomeri. Utilizziamo cellule CD34+ perché, oltre ad essere i progenitori della linea mieloide, hanno un alto livello di attività della telomerasi, attività che può essere però deregolata in risposta a citochine. Non consideriamo altre cellule in quanto l’attività della telomerasi è bassa in tutte le cellule ematopoietiche eccetto che nei progenitori CD34+ e CD71+.

6 Experimental Plan Expression vector (3rd generation)
Isolation of bone marrow cells Abbiamo scelto di utilizzare il vettore lentivirale d’espressione pSMPUW di terza generazione fornito da Cell-biolabs (Cat.No. VPK211) e contenente 5’ CMV/LTR, sito ψ, sequenza cPPT, MCS, WPRE 3’, LTR, Kanamycin Resistance gene, per un totale di 4632 bp. Essendo il vettore promoterless chiederemo alla stessa ditta, che ne dà l’opportunità, di inserire il promotore costitutivo hPGK (fosfoglicerato chinasi umano). La ditta fornirà, inoltre, anche i vettori di packaging e di envelopment. All’interno del MCS (Multi Cloning Site) inseriremo il cDNA dell’isoforma più lunga di DKC1 wt (2540nt) da ordinare presso la OriGene che lo fornisce all’interno di vari plasmidi. Quello da noi scelto è pCMV6-Neo, che ha all’interno già il marcatore di selezione per cellule superiori Neo; abbiamo scelto questo marker anziché il gene reporter eGFP perché quest'ultimo presenta un certo livello di tossicità. Il plasmide verrà poi amplificato come indicato dal fornitore trasformando cellule competenti di E.coli e successivamente purificato in colture utilizzando appositi kit. Fatto questo si procederà ad amplicazione, mediante PCR, utilizzando primer con code di restrizione per enzimi non presenti nella regione di interesse (cDNA, SV40, Neo) e che permetteranno l’inserimento del cDNA di DKC1 e del gene di selezione all’interno dell’MCS del vettore lentivirale, previa digestione dello stesso. In maniera analoga si procederà per HSV tk: è possibile ordinarlo presso l’InvivoGen all’interno del plasmide pSELECT-zeo-HSV1tk. Sarà anch’esso amplificato, purificato e addizionato di code di restrizione a valle di quelle usate in precedenza (anch'esse non devono essere presenti all'interno di HSV tk), mediante PCR, per la successiva integrazione nel vettore lentivirale a valle del cDNA di DKC1. Sfrutteremo le proprietà del gene suicida per eventuali problemi che in vivo potrebbero arrecare danni gravi all'organismo. Il nostro lentivettore pSMPUW può contenere sequenze fino a circa 10kb; tenendo conto di ciò abbiamo deciso di utilizzare gli elementi cDNA di DKC1 (2540bp), polyA+SV40ori+ Neo (1841bp) e HSV tk (1155bp), arrivando così ad una lunghezza di 5536bp. Produrremo il vettore lentivirale in cellule 293T con successivo prelievo del supernatante con particelle pseudo-virali e trasduzione di cellule del midollo osseo precedentemente isolate da pazienti affetti da DC o da volontari sani (protocollo Per la produzione delle particelle pseudovirali inizieremo con il piastrare le cellule 293T e successivamente cotrasfetteremo con il costrutto d’espressione e il mix di packaging fornito nel kit. Dopo ore dalla co-trasfezione si potrà raccogliere il supernatante; questo verrà centrifugato per eliminare i residui delle cellule e filtrato. A questo punto sarà necessario ottenere una soluzione più concentrata di virus, prima di trasdurre le cellule del midollo osseo; per questo step potremo utilizzare il ViraBind™ Lentivirus Concentration and Purification Kit (Cat.No. VPK-090 Cells-biolabs). Si procederà quindi con la quantificazione mediante il saggio ELISA su p24. La proteina p24 si trova nel nucleocapside del virus ed è codificata dal gene gag; essa può essere utile per la titolazione delle particelle pseudovirali attraverso il saggio ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Un anticorpo specifico per la proteina p24 viene attaccato ad un supporto polimerico, si aggiunge una goccia del campione (nel nostro caso il supernatante contenente le particelle pseudovirali ottenute mediante trasfezione di cellule 293T) e dopo aver lasciato formare i complessi antigene-anticorpo, il supporto solido viene lavato abbondantemente. Successivamente viene aggiunto un anticorpo secondario anti-p24 cui è legato un enzima che emette fluorescenza, come, ad esempio, la fosfatasi alcalina, che converte rapidamente un substrato incolore in un prodotto colorato oppure un substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente. L'ELISA è un saggio con una efficienza elevata, permette, infatti, di misurare meno di un nanogrammo di una proteina. Il saggio così come descritto, però, presenta uno svantaggio: il supernatante che preleviamo dopo la cotrasfezione di cellule 293T non contiene solo p24 associate alle particelle pseudovirali ma anche p24 libera. Per ovviare a questo inconveniente decidiamo di utilizzare il kit della ditta Cell Biolabs (Cell Biolabs Quick Titer Lentivirus Titer Kit), che è in grado di discriminare le molecole p24 associate al core delle particelle pseudovirali da quelle libere nel supernatante, misurando la differenza tra virus totale e virus nel pellet. La titolazione del lentivirus viene effettuata in due passaggi: p24 Titer (Virus associated p24, ng/mL) = p24 (ng/mL) x Diluition Factor x 0.25 mL/1.0 ml; ad ogni particella pseudovirale (LP: Lentiviral Particle) sono associate circa 2000 molecole di p24; in base alla quantità di p24, decideremo la Multiplicity Of Infection (MOI), secondo la conversione sul protocollo del kit. Il passaggio successivo sarà l’espianto di cellule del midollo osseo e l’isolamento di progenitori CD34+ mediante l’utilizzo di Miltenyi CD34 isolation kit, MidiMacs, SuperMacs separation column e reagenti forniti dalla Baxter Heathcare, da utilizzare secondo le indicazioni fornite dal produttore. Le cellule CD34+ saranno coltivate utilizzando un terreno medio arricchito con fattori di crescita umani. Affinchè i dati da noi ottenuti risultino statisticamente significativi, considereremo almeno 10 campioni, tra cui 5 volontari sani e 5 malati affetti da DC causata da mutazioni in DKC1; alternativamente si possono richiedere le cellule a specifiche cells bank come ATCC. Production pseudoviral particles

7 Experimental Plan Evaluation of transfection efficiency
Le cellule che hanno integrato il transgene verranno selezionate attraverso l’aggiunta di neomicina al terreno e contate attraverso il metodo della camera di Burker; valuteremo, quindi, l’efficienza di trasfezione confrontando il numero di cellule dopo l’aggiunta di neomicina con quello precedente al trattamento. Successivamente procederemo con uno step di retrotrascrizione sul trascritto totale della cellula. I livelli di espressione del transgene saranno quantificati mediante Real-Time PCR, utilizzando oligo specifici per DKC1. Il saggio sarà svolto sia su campioni di cellule CD34+ di pazienti affetti che su campioni di volontari sani. Considerando cellule non trattate, campioni trattati con il vettore senza transgene e campioni trattati con il vettore contenente DKC1 wt, potremo osservare un eventuale aumento nell’espressione di DKC1 nel trattato rispetto ai controlli. La proteina tradotta sarà quantificata mediante Western Blot e anche in questo caso utilizzeremo campioni di pazienti affetti e volontari sani; le cellule usate saranno: non trattate, trattate con vettori privi di transgene e trattate con il nostro vettore. L'intensità delle bande, oltre che dall'osservatore, potranno essere quantificate da un software che utilizza un sistema densiometrico, ad esempio ImageJ Software (scaricabile gratuitamente da ). Il Western Blot è un saggio che permette di verificare che effettivamente avvenga la sintesi della dyskerina; infatti non è detto che ad un aumento della trascrizione corrisponda necessariamente un aumento della traduzione, l’mRNA potrebbe infatti essere degradato da uno dei numerosi sistemi regolativi post-trascrizionali della cellula. Evaluation of expression level of DKC1 (RT-PCR)

8 Experimental Plan Evaluation: telomerase enzymatic activity
lenght of telomeres (Q-FISH e Southern Blot) Il risultato che ci si aspetta dalla terapia è un aumento dell’attività enzimatica della telomerasi (Millipore - TRAPEZE® RT Telomerase Detection Kit) con conseguente allungamento dei telomeri. La lunghezza dei telomeri nelle cellule dei pazienti affetti prima e dopo la terapia verrà confrontata con Q-FISH. Quantitative Fluorescent in situ hybridization (Q-FISH) è una tecnica citogenetica, variante della FISH tradizionale. È necessario avere oligonucleotedi taggati chiamati peptide nucleic acid (PNA) per quantificare la sequenza target sul cromosoma utilizzando microscopia a fluorescenza e software specifici. Questo tipo di tecnica è usata soprattutto per la misura della lunghezza dei telomeri, amplifica tutte le sequenze telomeriche della popolazione cellulare studiata ed esprime il contenuto totale delle stesse nel campione come rapporto tra numero di copie amplificate delle ripetizioni telomeriche e numero di copie amplificate di una sequenza genica di controllo, presente nel genoma in copia singola. Il risultato si esprime in termini di T/S value (= telomere/ single copy gene ratio). Questa tecnica presenta alcuni vantaggi: rapidità e sensibilità (sono sufficienti quantità di DNA dell’ordine di nanogrammi); efficacia anche in presenza di telomeri molto corti; possibilità di essere eseguita anche su materiale degradato o fissato; risultati non falsati in quanto non vengono amplificate le regioni subtelomeriche. Non fornisce alcuna indicazione riguardo la distribuzione della lunghezza telomerica. Seguiremo per i vari passaggi il protocollo indicato nell’articolo Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH) del 2001 di Poon SS e Lansdorp PM (Curr Protoc Cell Biol.) In alternativa alle tecniche di FISH potremmo anche effettuare l’analisi mediante Southern Blot. Il DNA genomico viene digerito con enzimi di restrizione specifici che non tagliano all’interno delle sequenze telomeriche, così da lasciare intatti i telomeri di ciascun cromosoma. I frammenti vengono poi separati con elettroforesi su gel di agarosio ed i TRFs (Terminal Restriction Fragments) vengono identificati per ibridazione con sonde specifiche in Southern Blot. Questa tecnica ha però alcuni svantaggi: richiede quantità di DNA dell’ordine di microgrammi, quindi sono necessarie almeno 105 cellule; i TRFs così tagliati possono comprendere, oltre alle sequenze prettamente telomeriche, anche frammenti variabili della regione pretelomerica. Essa è costituita da una porzione di 0-1kb contigua all’estremità prossimale del telomero e contenente ripetizioni di varianti a singolo nucleotide delle sequenze telomeriche (TVR: Telomere Variant Repeats) e da una regione subtelomerica prossimale che è uno dei loci più dinamici e variabili del genoma. L’eterogeneità di lunghezza dei TRF può quindi essere significativamente influenzata da componenti non telomeriche; essendo l’identificazione delle sequenze telomeriche basata su un processo di ibridazione, quanto più corto è il telomero tanto meno efficace sarà l’ibridazione, fino ad una lunghezza soglia al di sotto della quale la terminazione telomerica non verrà individuata. La metodica non è quindi in grado di identificare i telomeri più corti; il risultato dell’analisi viene espresso come lunghezza telomerica di picco oppure come media delle lunghezze dei telomeri dei diversi cromosomi di ogni cellula e di tutti i tipi cellulari presenti nel campione. Allo stesso tempo, però, il metodo è in grado di descrivere la lunghezza telomerica e la distribuzione della stessa per l’intero genoma.

9 Future prospectives Se gli esperimenti in vitro forniranno i risultati sperati, cioè un recupero dell’attività del complesso della telomerasi e un successivo allungamento dei telomeri, potremo procedere con la stessa terapia su modelli animali (in primis Mus musculus) e intraprendere, in un secondo momento, un trial clinico su pazienti affetti da DC con mutazioni nel gene DKC1. Per fare questo acquisteremo un topo KO per DKC1 presso l'International Mouse Strain Resource (IMSR) e lo useremo come modello per la nostra patologia. Sia per il modello animale che per quello umano il passaggio successivo è il reimpianto delle cellule modificate in vitro nei rispettivi organismi. Per il modello murino, in particolare, esistono un promotore PGK ed un gene codificante per la dyskerina specifici; verranno eseguite le stesse direttive precedentemente utilizzate nelle cellule umane in vitro. In vivo, inoltre, potremo verificare ulteriormente la nostra terapia valutando il numero di cellule del sangue: mentre nello stato patologico spesso c’è un’insufficiente produzione di queste cellule, DKC1 wt dovrebbe riportare il numero di cellule del sangue verso valori normali.

10 Pitfalls and solutions
Mutations for random insertion of vector Suicide gene to eliminate the therapy (HSV tk) Upregulation of DKC1 (DKC1 endogenous + exogenous one) Il lentivirus non si integra in siti preferenziali, quindi uno dei problemi che potrebbe verificarsi dopo la somministrazione della terapia è una mutazione inserzionale con conseguenze più o meno gravi per l'organismo, come ad esempio mutazioni frameshift nel genoma che possono portare alla produzione di proteine tronche o non funzionali. In vivo potremmo ovviare a questo problema somministrando il ganciclovir e uccidendo le cellule che avevano precedentemente integrato il vettore virale. Il ganciclovir è un analogo sintetico della 2-deossiguanosina che, in presenza del prodotto del gene HSV tk, viene fosforilato ed entra in competizione con il GTP per l’incorporazione nella catena nascente da parte della DNA polimerasi; il risultato è una terminazione prematura dell’elongazione replicativa che porterà a morte cellulare. Un altro inconveniente che potremmo riscontrare è un over-espressione della proteina DKC1 tale da provocare fenomeni di apoptosi cellulare. In questo caso si procederà con la riduzione della quantità di virus trasfettante. Apoptosis

11 Costs 293T cells 80$ www.abgent.com/products/CL1032_293T_Cell_Line
pSMPUW Universal Lentiviral Expression Vector (Promoterless) Cat.No. VPK211 OriGene 415$ pSELECT-zeo-HSV1tk Invivogen (we have to contact the company) CD34 MultiSorting Kit Human Cat.No. Macs Kit PCR, restriction enzyme, ligase ecc. around 1000 € QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (200) 850 € EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) 352 € One Shot® Stbl3™ Chemically Competent E. coli 424 € OriGene Cat.No. SC $ Southern and Western around 400 euro Kit Elisa Quick titer lentivirus titer Kit (lentivirus-associated HIV p24) around 400 euro RT telomerase detection Cat. No. S7710 Millipore (we have to contact the company) Neomycin solution Cat.No. N ML Sigma-Aldrich 14.70€ growth medium , growing factor, ecc Laboratory: flasks, vials, tubes…

12 References Alter BP et al., Blood Sep 1;110(5): Very short telomere length by flow fluorescence in situ hybridization identifies patients with dyskeratosis congenita. Knight SW et al.,Am J Hum Genet Jul;65(1):50-8. X-linked dyskeratosis congenita is predominantly caused by missense mutations in the DKC1 gene Vulliamy T et al., Nat Genet May;36(5): Disease anticipation is associated with progressive telomere shortening in families with dyskeratosis congenita due to mutations in TERC. Marrone A et al.,Blood Dec 15;110(13): Telomerase reverse-transcriptase homozygous mutations in autosomal recessive dyskeratosis congenita and Hoyeraal-Hreidarsson syndrome. Vulliamy TJ et al., Blood Cells Mol Dis May-Jun;34(3): Mutations in the reverse transcriptase component of telomerase (TERT) in patients with bone marrow failure Savage SA et al., .Am J Hum Genet Feb;82(2): TINF2, a component of the shelterin telomere protection complex, is mutated in dyskeratosis congenita. Vulliamy TJ, et al. Biochimie Jan;90(1): Dyskeratosis congenita: the diverse clinical presentation of mutations in the telomerase complex. Walne AJ et al.Hum Mol Genet Jul 1;16(13): Genetic heterogeneity in autosomal recessive dyskeratosis congenita with one subtype due to mutations in the telomerase-associated protein NOP10 Ricks DM et al..Stem Cells Dev Jun;17(3): Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells Qasim W,.et al. Mol Ther Feb;15(2): Lentiviral vectors for T-cell suicide gene therapy: preservation of T-cell effector function after cytokine-mediated transduction. ghr.nlm.nih.gov/condition/dyskeratosis-congenita WuMH et al. Bone Marrow Transplant 2001 Jun;27(11): Optimization of culture conditions to enhance transfection of human CD34+ cells by electroporation. Maxim A. Blood September 15; 108(6): 2095–2105. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures Poon SS, LansdorpPC. Current Protocol Cell Biology 2001; Chapter 18: Unit18.4. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH) Grabowski P. Blood : Telomere lenght as a prognostic parameter in chronic lymphocytic leukemia with special referenze to VH gene mutation status Baird DM. Exp Gerontol 2005; 40: New developments in telomere lenght analysis Chiu CP et al. Stem Cells 1996 Mar; 14(2): Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow.


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