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临床用 PCR 检测常见的问题及 科华 PCR 试剂特点 曹玉峰 上海科华生物工程股份有限公司. 目前 PCR 的应用 核酸是最基本的生命物质,其贮存着生物体的全 部遗传信息,直接或间接的参与所有生命过程。 理论上任何疾病都能在核酸水平找到证据。 随着对核酸功能认识的逐渐深入,核酸检测在医疗诊 治过程中起着越来越重要的作用。

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1 临床用 PCR 检测常见的问题及 科华 PCR 试剂特点 曹玉峰 上海科华生物工程股份有限公司

2 目前 PCR 的应用 核酸是最基本的生命物质,其贮存着生物体的全 部遗传信息,直接或间接的参与所有生命过程。 理论上任何疾病都能在核酸水平找到证据。 随着对核酸功能认识的逐渐深入,核酸检测在医疗诊 治过程中起着越来越重要的作用。 核酸检测在临床上主要应用于: 能用于遗传性疾病、肿瘤以及感染性疾病的筛查以及 疗效监测等方面 由于对基因功能认识的限制,国内主要进行病原体载 量检测,用于疗效监测

3 核酸检测的特点 核酸检测相对于传统的生化、免疫检测有着不同 的检测方法及生理意义。 早期筛查:应用 PCR 进行早期筛查主要是因为 PCR 的 高灵敏和短的窗口期。 疗效监测:反映抗病毒治疗效果的最好指标。 核酸是病毒存在的直接证据,用核酸定量作为监测指 标更灵敏。而传统的血清标志物有滞后效应,效果不 如核酸理想。 与酶免检测互补: 方法学互补,可以避免亚型或免疫沉寂引起的漏检 临床作用互补

4 临床 PCR 检测的常见问题 假阳性问题 方法学问题 污染问题: 样本污染、产物污染 假阴性问题 试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素 定量问题 外标定量与内标定量

5 假阳性问题及解决办法 方法学: PCR 是特异性非常高的检测方法 PCR 引物决定了特异性 靶基因序列的特异性、引物错配、非特异性扩增 实时荧光( Real-time ):引物探针同时控制,几乎没有方法学假 阳性问题 污染: 样本污染:应属于操作失误,所有技术都存在,但由于 PCR 高敏 度轻微污染也能被检出。 产物污染:最严重的问题 PCR 产物是极高浓度的,所以很可能产生污染 解决办法: 使用实时荧光技术 严格分区及实验人员培训 使用 UNG 技术

6 UNG/dUTP 消除产物污染 原理: UNG 酶是一种限制性水解酶,会将 dUTP 降解。 在 PCR 体系中以 dUTP 代替 dTTP ,这样合成的 产物就含有 U ,而模板只含 T 不含 U ,如果出现 产物污染, UNG 酶会降解掉产物,而对模板无 影响。 步骤: UNG 酶反应, 50 ℃ UNG 酶灭活, 94 ℃ 开始扩增循环

7 UNG/dUTP 消除产物污染

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11 假阴性问题及解决办法 试剂因素 阳性对照可以监测和发现 操作因素 提高操作人员素质 降低操作难度(柱提取、磁珠提取等) 阳性对照监控 仪器因素 离心、温度控制精确度 仪器故障、由阳性对照(或标准曲线)监控 孔间因素,使用内对照监控 标本因素 使用抗干扰能力强的试剂(煮沸二步法、柱提取等) 使用内对照

12 定量相关的问题 外标定量的前提: 假设所有扩增的扩增效率一致 所以能影响扩增效率的因素都能影响定量结果 核酸定量没有决定性方法 只有同类著名试剂(罗氏)作为参照标准 PCR 定量重复性不好, 10 倍以为大体都正确, 不能同生化类比 PCR 标准品没有准确的定量值 国家标准也是 8 倍左右的范围值

13 外标定量与内标定量 内标定量 将标准品加入样本中一齐处理、检测 优点: 标准品和样本的反应完全一致,误差最小定量最准确 缺点: 只能一点定标,线性范围有限,PCR定量是指数级范围,不 适用 标准与样本的信号区分要不同的检测信号,难度大,成本高 外标定量 标准同批,分管处理检测 优点: 能做标准曲线定量,线性范围宽 成本低,易实现 缺点: 反应情况的同步性不如内标定量

14 科华 PCR 试剂盒特点 及新进展

15 试剂盒三大特点: 提供负压纯化柱提取及磁珠提取方法 使用双色荧光设计内标,避免假阴性 标准品参与提取

16 PCR 检测核酸提取是关键 自动化程度已 经很高,操作 难度已经降低 成为操作难点, 是保证实验结果 的关键。 核酸提取 循环扩增 结果检测与分析

17 PCR 的新进展 酶的稳定性增强 经过免疫或化学修饰后酶的稳定性有大幅度增 强 但配置后长期存放仍然不利 提取方法的进步 煮沸、柱提取、磁珠提取 自动化 半自动、全自动

18 常见的核酸提取方法 煮沸法 柱提取磁珠法 一步法二步法 裂解方法煮沸 化学裂解 分离方法离心 亲和吸附吸附或杂交 步骤 1. 煮沸裂解 2. 离心,去除大 分子的抑制物 3. 取上清扩增 1. 加入沉淀剂 2. 离心弃上清, 浓缩标本并去 除小分子抑制 物 3. 煮沸裂解 4. 离心,取上清 扩增,去除大 分子抑制物。 1. 化学裂解 2. 过柱吸附 3. 洗涤 4. 洗脱 5. 取洗脱液扩增 1. 化学裂解 2. 加磁珠吸附 3. 洗涤 4. 洗脱 5. 取洗脱液扩增 抗干扰能力差较好好最好 提取物组分较小分子量的混合 物 与核酸相似分子量 的混合物 全核酸特定病原的核酸 自动化程度手工 手工或自动半自动或全自动

19 煮沸法提取核酸 第一步:加沉淀剂,离心弃上清 去除小分子聚合酶抑制物 浓缩病毒颗粒,提高灵敏度 第二步:加裂解液,煮沸 裂解病毒颗粒,游离核酸 变性残留蛋白质 第三步:取上清扩增 去除大分子聚合酶抑制物

20 负压纯化柱抽提原理 原理:采用硅胶膜特异 性吸附核酸,而对其 他生化组分如蛋白质、 多糖、脂类既不相亲 也不吸附,因而可得 到纯化的核酸

21 负压纯化柱抽提操作 裂解 ↓ 移入柱 ↓ 洗涤两次 ↓ 洗脱

22 负压纯化柱抽提的优点 操作难度低,易于掌握 纯度高 适应性强:能用于各种 DNA 、 RNA 病毒 提取物可用于其他分子生物学检测 对离心要求低 对实验环境无污染

23 磁珠法提取原理 原理: 标本中的病毒经裂解、消化后,释放出病毒核酸,核 酸与磁珠结合 ( 特异性的和非特异性的 ) 利用磁珠分离仪 器将病毒核酸提取纯化,作为 PCR 反应的模板。 分类: 亲和法:提取全核酸,特异性差 杂交法:利用特异性探针捕获,提取目标核酸 步骤: 裂解、吸附、洗涤、洗脱

24 科华磁珠提取试剂 自动化模式:采用国内国外的相关的全自动或半自动核酸提取仪,实 现了自动化抽提核酸 高通量,时间短:一次可处理 96 份标本,仅需 80 分钟 同步提取: RNA 病毒、 DNA 病毒核酸同步提取;基于探针杂交原理, 特异性捕获病毒的核酸; 为目前 FDA 批准的血液核酸筛查试剂 ----Roche 的 “AmpliScreen®” 及 Gen-probe 的 “TMA” 均所采用的标本处理方法,代表当前最先进、最 灵敏的标本提取方法 灵敏度高: HBV,HIV 均为 25copies/ml, HCV 为 50IU/ml 特异性强:基于杂交原理, 特异性捕获病毒的核酸,抗干扰性能强 重复性好:连续八次(不同日内)检测不同浓度的标本,结果 CV 不 大于 5% 通用性强,适于各种磁珠提取核酸仪器。

25 灵敏度 灵敏度: HBV,HIV 均为 25copies/ml, HCV 为 50IU/ml 梯度稀释的样本 10 2 能 100% 检出 10 1 能检出 60% 以上 通过离心浓缩可以确保 10 - 20 份样本 POOL 保持同等的检出率

26 重复性(批内) 孔间 CV :试剂检测灵敏度以上、线性范围内的标本的孔间 CV 不大于 5%

27 重复性(批间) 连续八次(不同日内)检测不同浓度的标本,结果 CV 不大于 5%

28 抗污染性实验 按矩阵以 1×108copies/ml 的血清包围中间一份阴性血清,以及阴性血清包 围 1 份 1×108copies/ml 的血清;重复三次,未见污染发生。

29 操作步骤 试剂准备 取 6 块反应板,分别用排枪或滴瓶加入去抑制 剂、磁珠、洗涤液 A 、洗涤液 B 、洗涤液 C 以及 洗脱液 量产后,可以将试剂封入板中不在需要准备 在第一块板中加入待检血样 跟据提取仪的不同,上机提取 用排枪将洗脱液加入相应的扩增反应板中 进行扩增检测

30 配套磁珠仪器 试剂通用性强 绝大部分磁珠核酸提取仪器均能使用(有加热模块即 可) 自产配套磁珠提取仪器 具有高效的加热模块、稳定的温控系统 非板式混均系统 程序预设控制 预防污染设计 体积小能放入生物安全柜操作 很高的性价比

31 内标设计原理 内标为一已知低含量的 与模板扩增效率相似的 一段 DNA 片段,将它加 入 PCR 反应液中,与模 板共同扩增,以反应每 管真实的扩增情况,如 果内标和样品都未扩增 出结果,则表示该管扩 增无效,应重新做。 样本 内标

32 内标:避免假阴性 内标的种类: 同源、异源、竞争、非竞争 使用竞争性内标 真实反应扩增情况 建立每管质控体系 避免假阴性 科华试剂不使用内标定量 由于线性范围原因,仍用外标定量

33 标准品参与提取 标准品与标本同样处理结果更准确 重复性更好 定量更准确 不需要额外的阳性对照 实质上四个阳性对照 降低了成本

34 Fluocycle PCR 实时荧光 PCR 仪

35 产品特点 全中文临床中文软件:界面友好,易于操作。 采用空气加热系统,温度升降速度快: 升温速度大于 6 ℃ ∕S ,降温速度大于 5 ℃ ∕S 。 采用玻璃毛细管作反应管,表面积 / 容积比较高,确保管内温度与热室 的迅速平衡 标本用量少, 每个样本量仅需 20ul 。 寿命超高亮度的 LED 光源。 PMT 检测。 完善的数据输出方式:列表形式以及报告形式任意选择。 最多可检测 3 个波长的激发荧光(包括 525nm , 640nm , 710nm )。 实时检测,绝对定量:可实时监控、显示样品的动态反映,检测结果 即样品原始浓度。

36 乙肝新药证书及生产批文 国药证字 S 国药准字 S

37 国药证字 S 国药准字 2004S03676 丙肝新药证书及生产批文

38 谢 谢 !


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