1. An Ultrahigh Resolution Accurate Mass LC/MS solution to Forensic Toxicology Screening in Serum

2. Presentation overview
Introduction to Exactive benchtop LC/MS system
List of drugs monitored in serum
Sample preparation
LC/MS method overview, HPLC and UPLC
Resolution and mass accuracy data
Identification performance
LOD vs resolution & concentration
Conclusions
Appendix

3. Exactive™ a short introduction
Collision cell
C-Trap
Octapole
Split Lens
Flatapole
Skimmer
Tubelens
Capillary
Orbitrap
Voici le chemin optique de l‘Exactive. Les ions sont générés par une source API de type electropsray ou APCI. Ils sont ensuite transférés via une série de lentilles et d‘octapole vers la C Trap ou ils sont piégés puis envoyés par pulse vers l‘OrbiTrap.
Dans le cas ou l‘on ferait de la fragmentation en mode HCD, les ions sont tout d‘abord envoyés vers la cellule de collisions puis transférés vers l‘OrbiTrap via la Ctrap. Une fois les ions présents dans la C Trap, . Leur Mvt va induire un courant d‘electrons. Les ions placés dans une champ électriques sont animés d‘un mouvement dont la fréquence radial est directement lié à leur rapport m/z. La fréquence des oscillations axiales induit un courant que l’on appelle courant image sur les électrodes. C’est ce signal qui est analysé par Transformé de Fourier.
La flatapole est à 90°C pour des raisons d‘encombrement. Les barres du quadrupole sont carrés au centre de manière à limiter la taille des oscillations. On peut ainsi mettre à al suite des lentilles de diamètre plus faibel et obtenir un meilleur vide.
Ions are injected through the source
…and trapped in the C-trap and
squeezed into a smaller cloud
…then a voltage pulse across C-trap
ejects ions towards the Orbitrap
…where they are trapped and detected 3

4. Orbitrap – Principle of Operationz φ
Hyper-logarithmic potential distribution:
“ideal Kingdon trap” r
Characteristic frequencies:
Frequency of rotation ωφ
Frequency of radial oscillations ωr
Frequency of axial oscillations ωz
Makarov A. Anal. Chem. 2000, 72,

5. The 40 drugs in serum
Concentrations : 0.4 µg/L mg/L for most drugs
Isobars
Isomers
Amitriptyline
LSD
Phenobarbital
Bromazepam
Maprotiline
Prazepam
Buprenorphine
Methadone
Quinine
Citalopram
Nadolol
Quinidine
Clobazam
Norbuprenorphine
THC COOH
Clomipramine
Norclobazam
THC Delta 9
Clonazepam
Norcyamemazine
Thiopental
Cyamemazine
Nordiazepam
Tramadol
Declomipramine
Norfluoxetine
Venlafaxine
Diazepam
NorLSD
Verapamil
EDDP
Normaprotiline
Zolpidem
Fluoxetine
Nortritpryline
Zopiclone
Glibenclamide
Norvenlafaxine
Hydroxyzine
Oxazepam
Mettre les masses exatces et souligner les isomeres/isobare. Et ajouter les concentrations…
Note: Lowest concentration samples prepared by dilutions with a mixture 80/20 A/B

6. Serum sample preparation protocol
Liquid Liquid Extraction
1000 µL human serum
Add 200 µL 20% Na2CO3
Add 5mL ether
Vortex 1 minute
Separate organic layer
dry at 40 deg C under N2
Reconstitute in 400 µL 80/20 A/B
Inject 10ul

7. LC/MS method overview HRMS method ESI source Mass range 100 – 800 amu
Res: 10K, 50K, 100K
Pos/Neg switching
HCD MS/MS after every MS scan
100,000
R =10,000
1 Second
0.1 s
Pos. Full Scan MS Neg. Full Scan MS Pos. Full Scan MS
Alternate Scan Polarity Switching
Pos. HCD Neg. HCD

8. Mass accuracy for identification
Mass accuracy not affected by concentration or resolution
1000 mg/l
100 mg/l
10mg/l
1mg/l
100µg/l
100k
50k
10k
…..
Imipramine
2.5
2.4
1.4
2.9
1.7 3
2.7
1.1
3.4
2.2
Levomepromazine
3.5
3.6
3.7
3.3
3.8
3.9
3.2
4.4
Lidocaine
1.8
1.9
2.6
2.3
1.2
2.1
All molecules (ppm)
2.8
3.0
3.1
No impact of the sensitivity on massa accuracy. Idem within an HPLC peak. External concentration. Mass accuracy mesurées sur la base d’ 1 seul scan, pris au sommet des pics chromatos ; pas besoin de moyenner comme sur TOF
Rajouter un exemple ou la précision en masse se dégrade en fonction de la résolution. Dynamique in scan.Idem..
Note: Data on standards using external mass calibration

9. Impact of concentration and resolution on identification
35 drugs identified with exact mass and RT upto 10 µg/L
Extra confirmation with at least one fragment ion for most drugs
Selectivity example 45 40 35 30
Zolpidem 0.4 µg/L 25 20 15 10
5 ppm Massa accuracy. 1 compound has not been identified even at 1.25 ppm. It’s thiopental. 100k is always better than 10k. N is the number of molecules identified. 5
100k
10k
100k
10k
100k
10k
100k
10k
100k
10k
100k
10k
1.25 mg/L
250 µg/L
50 µg/L
10 µg/L
2 µg/L
0.4 µg/L
Buprenorphine 1 µg/L
Note: Identification with 5 ppm accuracy

10. Impact of resolution on isotope ratio matching for confirmation
Resolution ~ 100,000 FWHM provided reliable isotope ratio confirmation
34S
Resolution
Olanzapine C17H20N4S
Resolution

11. Experimental and theoretical pattern match well
Accuracy of experimental isotope pattern - Bromazepam
Experimental and theoretical pattern match well
EXPERIMENTAL
m/z Intensity Relative
THEORITICAL
m/z Intensity Relative
Diificulties to get this on TOF

12. Unique fragment ion additionally confirms Maprotiline
Additional confirmation using fragment ions
MS chromatogram
Maprotiline and Amitryptiline
identical mass
different structure
different RT
different fragment ions
Maprotiline
C20H23N
Amitryptiline C20H23N
Unique fragment ion additionally confirms Maprotiline
Fragment Maprotiline
Le mélange comme vous avez pu le voir contient une certain nombre de molécules isomères qui peuvent avoir dans certains cas des temps de rétention extrêmement proche comme c’est le cas ici avec la maprotiline et l’amittryptiline. Le temps de rétention seul ne permet pas de confirmer la présence ou non de l’une de ces molécules et pour cette raison nous avons identifié un fragment spécifique de la maprotiline qui n’est pas observé avec l’amitryptiline. La validation d’un résultat comme vous le savez est lié à un certain nombre de points. En ce qui concerne le cas présent on considère qu’il faut 4 points. Or nous avons 2 points pour le parent et 2?5 point pour le fils. Ce qui est suffisant pour valider le résultat.
XIC of fragment ion

13. Benefit of resolution for co-eluting compounds
Quinine and Bisprolol co-elute; 13C isotope mass of one matches with the other
HPLC data
Quinine C20H24N2O2
MW :
Bisoprolol C18H31NO4

14. Mass accuracy Bisoprolol 3 ppm Mass accuracy Bisoprolol 9 ppm
Benefit of resolution for co-eluting compound
Sample with both drugs - confirmation
Quinine 12C
Quinine 13C
Quinine + Bisoprolol
Bisoprolol 12C
Nous avons ainsi regarder le spectre de masse au temps de rétention de 8.4 min à deux valeurs de résolution différentes : et On observe la chose suivante : A de résolution, il est possible de séparer le bisoprolol de le l’isotope M+1 de la quinine et par voie de conséquence d’identifier le bisoprolol avec une précision à 3 ppm. Dans le cas ou nous travaillons à de résolution, il n’est pas possible de séparer les deux espèces. Par voie de conséquence, la précision en masse du bisoprolol passe à 9 ppm ce qui ne nous permet pas d’identifier le composé. On observe la même chose avec le Zolpidem et le Buflomedil qui sont deux composés qui coéluent égalemement dans ces condtions analytiques. La différence en masse entre les deux composés est de il est possible de distinguer les deux espèces à une résolution de alors que cela est impossible avec Il n’est donc pas possible dans ce cas de confrimer al présence de l’un ou l’autre des deux composés.
il faut insister sur ces slides et montrer les précisions en ppm sur le bisoprolol à 100 et 10K et un chromato qui montre qu’à 10K/5ppm le bisoprolol n’est pas détecté. Le commentaire est que sur des échantillons réels la très hte résolution est indispensable pour éviter les faux négatifs. Idéalement il nous faudrait des stats là-dessus, ça veut dire faire une étude de détectabilité en matrice à réso et concentrations décroissantes. Je sais on a été obligé de diluer en phase mobile mais on ne pourrait pas trouver d’autres cas à 400 ppt où les masses ont shifté ?? Regarder jusqu’à combien on peut descendre en elta à de résolution. Précier que la mass accuracy est 3 ppm avec la résolution de 100 et 9 avec la résolution de 10k. Idem avec Zolpidem/Buflomedil delat en masse k peut séparer.
Resolution 100,000
Mass accuracy Bisoprolol 3 ppm
Resolution 10,000
Mass accuracy Bisoprolol 9 ppm

15. Sensitivity increase with U-HPLC
7.9
5.3
68.4
23.7
26.3
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
Resolution 100k
Resolution 10k
No gain in Sensitivity (%)
Increase by 1 to 5x (%)
Increase above 5x (%)
Sensitivity gain with U-HPLC
5 X for ~70% drugs
Dynamic range
2 to 3 orders of magnitude (0.4 to 250ug/L)
% of drugs
LSD
LSD calibration curve from 40ppt to 125 ppm

16. HPLC/UPLC –1.25 mg/L in serum

17. Identification range comparison - HPLC vs UPLC
Best results with UPLC at 100,000 resolution
% drugs
Rajouter des courbes de quanti.
Ajouter une liste de mauvais répondeur. Ordonnées ?

18. Automated reporting with ToxID Software
Compound ID
Formula
Mass
Mass Accuracy
Retention Time
Adducts and fragments
Intensity

19. Conclusions
Ultra high resolution >50,000 needed for specificity in screening
Better than 5 ppm mass accuracy identified all drugs
Isotope ratio matching is reliable at 100,000 resolution
Additional confirmation using at least one fragment ion
UHPLC improved sensitivity by 5x over HPLC
Reduced run time by half to 13 minutes
LOD for most drugs ~ 2 ug/L
ToxID software is ideally suited for screening

20. Thanks To…. CHU Reims, Pharmacology/Toxicology ThermoFisher Scientific
Denis Lamiable, Guillaume Hoizey, Olivier Oget, Laurent Binet
ThermoFisher Scientific
Eric Génin, Lab manager.

21. Analysis of Benzodiazepines in urine using Exactive benchtop LC/MS system

22. Standards, QC and sample preparation
6 drugs at 250 ng/mL
from ElSohly Labs
QC sample
Lorazepam
Nordiazepam
Oxazepam
Temazepam
Hydroxyalprazolam
Desalkylflurazepam
Lorazepam-D4
Nordiazepam-D5
Oxazepam-D5
Temazepam-D5
Hydroxytriazolam-D4
Hydroxyalprazolam-D5
Aminoflunitrazepam-D7
Standards IS
Add 7 deuterated IS
Standard preparation
Sample preparation
Negative standard urine
2 mL urine
Add 12 Benzodiazepines
Hydrolysis
Add 7 deuterated IS
SPE
Standards IS
200 ul of extract
Lorazepam
Nordiazepam
Oxazepam
Temazepam
Hydroxyalprazolam
Desalkylflurazepam
Hydroxytriazolam
Aminoclonazepam
Aminonitrazepam
Aminoflunitrazepam
Hydroxyethylflurazepam
Diazepam
Lorazepam-D4
Nordiazepam-D5
Oxazepam-D5
Temazepam-D5
Hydroxytriazolam-D4
Hydroxyalprazolam-D5
Aminoflunitrazepam-D7
5 uL inject
Note: Blanks were negative standard urine spiked with IS at 1000 ng/ml

23. LC/MS Method
LC method
Mobile Phase
A: water containing 0.1% formic acid
B: ACN containing 0.1% formic acid
Column
Thermo Scientific Hypersil GOLD PFP 50x2.1 mm, 5 µm
Injection volume: 5 µL
Flow rate: 400 µL/min
Gradient
Time (min) % A %B
Exactive MS method
Resolution: 100,000
Source: ESI

24. 12 Benzodiazepines with 7 IS
Total ion chromatogram (TIC)
QC sample
200 ng/mL std
Benzodiazepines
elution window (0.9min)
Note: 4X throughput with LX – 4 multiplexing system

25. Blank – All IS elute within 0.9 min window
Very low background, low 0-3e3 for blank vs 2 - 5e6 for
Standards
Internal standards
Lorazepam-D4
Temazepam
Hydroxyethylflurazepam
Nordiazepam-D5
Hydroxytriazolam
Lorazepam
Oxazepam-D5
Diazepam
Hydroxyalprazolam
Temazepam-D5
Desalkylflurazepam
Aminoclonazepam
Hydroxytriazolam-D4
Nordiazepam
Aminonitrazepam
Hydroxyalprazolam-D5
Oxazepam
Aminoflunitrazepam-D7
Aminoflunitrazepam
Note: Blanks were negative standard urine spiked with IS at 1000 ng/ml

26. 200 ng/mL standard – All elute in 0.5 min window
Hydroxyethylflurazepam
Lorazepam-D4
Temazepam
Nordiazepam-D5
Lorazepam
Hydroxytriazolam
Oxazepam-D5
Diazepam
Hydroxyalprazolam
Temazepam-D5
Desalkylflurazepam
Aminoclonazepam
Hydroxytriazolam-D4
Aminonitrazepam
Nordiazepam
Hydroxyalprazolam-D5
Oxazepam
Aminoflunitrazepam
Aminoflunitrazepam-D7

27. 1000 ng/mL standard Lorazepam-D4 Hydroxyethylflurazepam Temazepam
Nordiazepam-D5
Lorazepam
Hydroxytriazolam
Oxazepam-D5
Diazepam
Hydroxyalprazolam
Temazepam-D5
Aminoclonazepam
Desalkylflurazepam
Hydroxytriazolam-D4
Aminonitrazepam
Nordiazepam
Hydroxyalprazolam-D5
Oxazepam
Aminoflunitrazepam
Aminoflunitrazepam-D7

28. 2000 ng/mL standard Temazepam Lorazepam-D4 Hydroxyethylflurazepam
Nordiazepam-D5
Lorazepam
Hydroxytriazolam
Oxazepam-D5
Hydroxyalprazolam
Diazepam
Temazepam-D5
Desalkylflurazepam
Aminoclonazepam
Hydroxytriazolam-D4
Nordiazepam
Aminonitrazepam
Hydroxyalprazolam-D5
Aminoflunitrazepam
Oxazepam
Aminoflunitrazepam-D7

29. Carryover - Much less than 1%
MeOH after
2000 ng/mL std
Hydroxyethylflurazepam
Lorazepam-D4
Temazepam
No analyte signal
Low background signal in
all channels
Nordiazepam-D5
Lorazepam
Hydroxytriazolam
Oxazepam-D5
Diazepam
Hydroxyalprazolam
Temazepam-D5
Aminoclonazepam
Desalkylflurazepam
Hydroxytriazolam-D4
Aminonitrazepam
Nordiazepam
Hydroxyalprazolam-D5
Oxazepam
Aminoflunitrazepam
Aminoflunitrazepam-D7

30. QC containing 6 drugs – 250 ng/mL(expected and found)IS  
Lorazepam-D4
Hydroxyethylflurazepam
Temazepam 
Nordiazepam-D5 
Lorazepam
Hydroxytriazolam  
Oxazepam-D5
Diazepam
Hydroxyalprazolam 
Temazepam-D5 
Desalkylflurazepam
Aminoclonazepam 
Hydroxytriazolam-D4 
Nordiazepam 
Aminonitrazepam
Hydroxyalprazolam-D5  
Oxazepam
Aminoflunitrazepam
Aminoflunitrazepam-D7

31. QC sample – Quant performance statistics

32. Conclusions
The method for Benzodiazepines analysis in urine meets all the criteria set by the forensic toxicology lab customer
Run time - 6min
Linearity range ng/mL
No carryover
Use of only 7 internal standards
Works on customer’s hydrolysis and SPE protocol
Recovery in high 90% for most drugs
The specificity of the system for this assay is equivalent or better than MRM on triple quadrupole LC/MS/MS system
Note: MRM data not shown here

33. Quantitation of Urinary Ethyl Glucuronide using Ultra High Resolution LC-MS System33

34. Goal
Develop a method to quantitate urinary Ethyl glucoronide (ETG) in Fortes lab (forensic toxicology lab customer) with the following characteristics
LOQ 500 ng/mL or better
Linearity range : ,000 ng/mL
Accuracy >15%
Carryover <1% of the highest concentration standard
Good correlation with reference lab method

35. LC/MS system
Accela LC System
Exactive System
Hypercarb 50x2.1mm 35

36. ETG calibrator and sample preparation
Concentration
ETG ng/mL
Cal 1
100
Cal 2
250
Cal 3
500
Cal 4
5000
Cal 5
10000
Add 100 uL ng/mL
1mL urine
Dilute 10X with H2O
10 uL inject
Sample preparation
Note: Internal Standard ETG-D5 ng/mL 36

37. Calibration standards chromatograms
ppm mass accuracy, res.100,000
100 ng/mL*
250 ng/mL
ETG
ETG IS IS
*not included in calibration curve

38. Calibration standards chromatograms
ppm mass accuracy
5000 ng/mL
10000 ng/mL
ETG
ETG IS IS

39. Calibration curve - 250 to 10000 ng/mL
Good linearity and accuracy
Note: 500 ng/mL standard analyzed in triplicate

40. No carryover
Blank urine after 10,000 ng/mL standard
No ETG peak IS

41. Urine samples
22665
21891
ETG > ng/mL
ETG: 4200 ng/mL IS IS

42. Urine samples
22287
22287
ETG > 10,000 ng/mL
ETG: 380 ng/mL IS IS

43. Comparison with reference lab results
21828
Comparison summary
ETG < 250 ng/mL
*Sample was injected twice IS

44. Conclusion
The method developed on Exactive LC/MS system meets all the criteria for ETG analysis set by Fortes lab (forensic toxicology lab customer)
LOQ better than 500 ng/mL
Good linearity between 500 – 10,000 ng/mL
Accuracy better than 15% (mostly better than 5%)
No carryover
Excellent correlation with established reference lab method

45. Appendix

46. LC-MS method LC-gradient Column Mobile phase Gradient method
Hypercarb 50 x 2.1, 5mm
Mobile phase
A: 20 mM ammonium acetate in DI water
B: ACN
Gradient method
Autosampler method
Injection volume: 20uL
Injection mode: no waste
Wash solution: 80% MeOH
Wash volume: 1000 mL
Flash volume: 1000 mL
LC-gradient
Time
(min) %A %B
Flow rate
(mL/min) 98 2
200 3
3.1 5 95
600
4.0
4.01
10.0

47. MS method Source parameters Data acquisition parameters ESI source
Sheet gas (units): 15
Aux gas (units): 10
Sweep gas (units): 0
Spray voltage (kV): 5
Capillary temperature (C0): 320
Capillary voltage (V): -82.5
Tube lens voltage (V): -135
Data acquisition parameters
Polarity: negative
Microscans: 1
Resolution: 100,000
Max inject time (ms): 100
Scan range (mu):
Probe position: C

48. Human urine data